アポプラスト抽出法による植物産生組換えタンパク質の純度向上

1. N. benthamiana植物の調製 苗ブロックをトレイに置き、1 Lの水を加え、完全に飽和するまで約2時間浸します。 野生型の N.ベンタミアナ の種子を苗ブロックに均等に振りかけ、蓋をして1週間発芽させます。 N. benthamianaを 18時間の日長、24°C、相対湿度45%の温室で栽培し、2週間ごとに施肥します。 種子が発芽したら、根に損傷を与えないように注意しながら、ピンセットを使用して苗をそっと取り除きます。新しいトレイの中央に小さな穴を掘り、その中に苗を置き、根を土で軽く覆います。蓋をして成長を続けます。 ふたをした状態で、苗に3枚の葉ができるまで育てます。4枚目の 本葉が出てきたらフタを外します。 植物が農業浸透する前に、さらに2週間成長を続けるのを待ちます。 2. 組換えGFP-Hisの構築 遺伝子配列に基づく N. benthamiana コドンの最適化と GFP および PR1a の合成 (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) を行います。 Xba IおよびSac I酵素を使用して、pCAMBIA1300ベクターの二重消化を行います( 材料表を参照)。 アップストリームプライマー(TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATTTGTTCTCTTTTC)およびダウンストリームプライマー(TCCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGCCCCGGCACCCAAGAGTGGG)、アップストリームプライマーを用いたGFPの増幅(CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA)およびダウンストリームプライマー(GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTGGTGAGATCTTCCGGACTTGT) です。 相同組換えを用いて、PR1aおよびGFPをpCAMBIA1300植物発現ベクターにクローニングします。 大腸菌に移管した後、単一のクローンを選択し、シーケンシングのために会社に送ってください。シーケンシング結果と右プラスミドとの比較は、組換えプラスミドpCAMBIA1300-PR1a-GFP-His(p35s-PR1a-GFP-His)です。 3. N. benthamianaにおけるGFP-Hisの作製 50μLの アグロバクテリウム 受容体細胞GV3101にGFPプラスミド1μLを加え、穏やかに混合して電極カップに加え、エレクトロショックャーで感電死した後に除去します。 形質転換 したAgrobacterium tumefaciensを 、50 μg/mL のカナマイシン(Kan)と 50 μg/mL のリファンピシン(Rif)を入った LB 固体培地プレートに広げます。インキュベートし、28°Cで48時間逆転させます。pCAMBIA1300ベクターはカン耐性があり、アグロバクテリウムはリフ耐性です。正しい アグロバクテリウム だけがkanとrifのプレートで成長することができます。モノクローナルクローンは、 A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG) と名付けられた正の形質転換体でした。 滅菌したつまようじを使用して適量のAtGPGを拾い上げ、KanとRifを液体LBの4mLに接種します。28°C、220-300rpmで24時間培養します。 細菌を1:50で新鮮なLB(50 μg/mL Kan、10 mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、20 μMアセトシリンゴン(AS))に継代培養し、28°C、220-300 rpmで10-12時間インキュベートします。 1500 x g で 10 分間遠心分離して細菌を回収し、1 mL の MMA (10 mM MgCl2、10 mM MES pH 5.6、100 μM AS) でペレットを再懸濁します。 MMAを使用して、AtGPGの光学密度(OD)をOD600 = 0.8に測定および調整します。細菌を室温でさらに2〜4時間インキュベートします。無針注射器で細菌溶液を引き上げ、葉の裏側に軽く押し付け、溶液を葉に浸透させるように圧力をかけます。植物ごとに真ん中の3〜4枚の葉だけを注入します。 タンパク質抽出のために葉を収穫する前に、温室で N.benthamianaを 3〜4日間栽培し続けます。 4. GFPの細胞内局在の観察 農業浸透の48時間後、平らな葉を選択し、6 mmの穴パンチを使用してパンチング用のブレードをクランプします。 スライドガラスに30%ショ糖溶液を滴下し、葉のサンプルを裏面を上にして置き、カバーガラスで覆います。 励起波長を488nmに設定し、400倍に倍率した後、490-550nmで緑色蛍光を検出します。スライドの準備が整ったら最初の写真を撮り、10分後に別の写真を撮ります。 5. 植物からのGFPの抽出 AWF 抽出アグロインフィルトレーションの3日後に、組換えGFPを発現する無傷の新鮮な N.benthamiana の葉を採取します。葉を優しく扱い、葉の完全性を維持して、細胞内タンパク質の流出を防ぎます。タンパク質の分解を避けるために、収集した葉をすぐに次のステップに使用してください。 葉身を予冷滅菌したddH2Oですすぎ、破片を取り除きます。 新鮮な葉を秤量し、20 gの葉(軸面を下にして)を100 mLの予冷済み100 mMリン酸緩衝液(PB 100 mM Na2HPO4 および100 mM NaH2PO4 を別々に構成し、200 mLの広口ビーカーで2.2:1 pH 7.0)で混合します。100メッシュのナイロン細メッシュ糸( 材料の表を参照)とプラスチックプレートで葉を覆います。注:予冷はタンパク質の分解を防ぎます。バッファ容量は、実験スケールに基づいて調整できます。すべての葉が浸されていることを確認してください。 ビーカーを真空ポンプに入れます。0.8MPaの真空を1分間印加した後、すぐに大気圧に戻します。 緩衝液から葉を取り除き、吸収紙でやさしく吸い取ります。葉を巻き上げ、メッシュ糸で包み、50mLの遠心チューブに5gの葉を入れます。AWFを回収するには、チューブキャップでメッシュ糸を固定したチューブに、葉の先端を上にしてロールします。 4°C、500 x g で5分間遠心分離します。葉を取り除き、ピペットを使用してチューブの底にAWFを回収します。各チューブから約5mLのAWFを採取できます。注:細胞内タンパク質からの干渉を最小限に抑え、最大量のAWFタンパク質を抽出するために、抽出は2x〜3x繰り返すことができますが、3xを超えることはできません。 全可溶性タンパク質抽出20 gの葉を液体窒素中で微粉末に挽きます。抽出バッファー(50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、10% グリセロール、1% Triton X-100、0.034% β-メルカプトエタノール( 材料表を参照))を 1:2 の比率で添加します。 ホモジネートを縦型ミキサーで4°Cで30分間振とうします。 ホモジネートを13,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清を新しいチューブに移し、遠心分離を15分間繰り返します。透明にした上清を別のチューブに移します。. 0.22 μmフィルター( 材料の表を参照)で上清をろ過し、全可溶性タンパク質抽出物を得ます。    6. ニッケル(Ni)アフィニティークロマトグラフィーによるGFP-Hisの精製 注意: すべての手順を4°Cで実行します。 Niセファロースエクセル樹脂( 材料表を参照)を、ステップ5.1.6のタンパク質抽出物容量に対して1:1000の比率でチューブに添加します。樹脂の量は、タンパク質抽出物の体積の1/1000に 等しい。 Ni樹脂を10倍の樹脂容量のddH2OとPB(pH 7.0)で別々に3回洗浄し、上清を取り除きます。 タンパク質抽出物をNi樹脂と2時間インキュベートして、完全に結合させます。500 x g で5分間遠心分離し、上清中の未結合タンパク質を除去します。PBの20倍のレジンボリュームで3回洗浄します。500 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。 250 mM イミダゾール (50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、10% グリセロール、250 mM イミダゾール) の 10x 樹脂量を添加して GFP-His を溶出し、上清を回収します。 7. タンパク質のクマシーブルー染色 10 μL の 5x SDS ローディングバッファーを 40 μL のタンパク質サンプルに加え、10 分間煮沸した後、15% SDS-PAGE で 110 V で 60 分間分析します。 タンパク質ゲルをクマシーブルー溶液(0.1%R-250、25%イソプロパノール、10%氷酢酸)で2時間染色します。 溶液を注ぎ、脱色液で2時間洗浄します。ゲルを観察します。ゲル上のタンパク質は青色に着色されます。 8. タンパク質のウェスタンブロッティング 10 μL の 5x SDS ローディングバッファーを 40 μL のタンパク質サンプルに加え、10 分間煮沸した後、15% SDS-PAGE で 110 V で 60 分間分析します。 タンパク質を280mAの0.45μmニトロセルロースメンブレンに移します。5%スキムミルクでメンブレンを1時間ブロックします。 抗Hisタグ抗体を1:5000で希釈し、メンブレンを抗体と1時間インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水とTween 20(TBST)を使用して、メンブレンを4回5分間洗浄します。 抗マウス抗体を1:10000に希釈し、メンブレンを抗体と1時間インキュベートします。TBSTを使用して、メンブレンを4回5分間洗浄します。 現像液( 材料の表を参照)を1:1の比率で混合します。メンブレンに400μLを加え、1分間反応させます。ビジュアライザーで1分間の露光後に写真を撮ります。 9. タンパク質濃度アッセイ Bradford 1x 色素試薬 1 mL に 5 μL のタンパク質を添加し、5 分間反応させます。 ゼロ調整後のOD595 値を決定し、標準曲線からタンパク質濃度を計算します。 10. タンパク質の定量 31 タンパク質サンプルのウェスタンブロッティングを標準試料と一緒に行います。 ImageJ 1.5.0グレースケール分析を使用して、標準に対する比率によるGFPの定量化を実行します。