概要

マウスのドリコ拡張症を誘発するための視覚的アプローチによる大血管媒介性脳血管機能障害のモデル化

Published: May 17, 2024
doi:

概要

脳血管機能障害のモデルとして、マウスに大血管拡張を化学的に誘導することを実証し、血管性認知症やアルツハイマー病のモデリングに用いることができます。また、シリコーンゴムコンパウンドを注入して血管系を可視化し、血管サイズの変化を測定するための明確な視覚的ガイダンスを提供する方法も示しています。

Abstract

血液脳(BBB)は、例えば、末梢部で選択的な脳循環を調節する重要なシステムであり、必要な栄養素が脳に過剰なアミノ酸や毒素を流入し、脳から排出することを可能にします。 血管性認知症(VaD)やアルツハイマー病(AD)などの疾患でBBBがどのように損なわれるかをモデル化するために、研究者たちは血管拡張をモデル化する新しい方法を開発しました。これらの疾患状態でBBBが損なわれると、有害であり、BBBの調節不全を引き起こし、脳機能に影響を与える不都合で病理学的な結果につながる可能性があります。私たちは、大槽(CM)に直接注入してエラスターゼを使用して血管の拡張を誘導し、BBBのタイトジャンクション(TJ)を破壊することを可能にする既存の技術を変更することができました。この方法により、一貫した血管拡張、死亡率の低下または回復の改善、シリコーンゴムコンパウンドである充填/混濁剤の改善、拡張分析のための血管標識送達の改善など、以前の技術に対する成功のさまざまな指標を確認することができました。この改良された低侵襲法は有望な結果をもたらしており、注射後2週間から3か月にかけてマウスの大血管の持続的な拡張が19%〜32%増加しました。この改善は、2週間の時点でのみ拡張の増加を示した以前の研究とは対照的です。追加のデータは、9.5か月後も持続的に拡大することを示唆しています。この増加は、エラスターゼとビヒクル注入群の血管の直径を比較することによって確認されました。全体として、この手法は、動物モデルを使用して中枢神経系(CNS)に影響を与える病理学的障害を研究するために価値があります。

Introduction

脳毛細血管の内側を覆う微小血管内皮細胞は、血液脳関門(BBB)1を形成する主要な構成要素であり、末梢の脳循環に出入りするものを調節する重要な役割を果たしています。神経組織に必要な必須栄養素はBBBに入ることが許可されていますが、グルタミン酸などの一部の必須アミノ酸は脳から排出されます。これは、高濃度が脳組織に永続的な神経興奮性損傷を引き起こす可能性があるためです2。通常の生理学的条件下では、BBBはアルブミン3,4やプロトロンビンなどの血漿タンパク質が脳に入るのを制限します5,6,7最後に、BBBは、食品や環境からの生体異物など、末梢を循環している神経毒から脳を保護します1。全体として、脳組織への損傷は不可逆的であり、低レベルの神経新生相関する老化8は、神経変性プロセスを加速するあらゆる要因を保護し、防止するBBBの重要性を強調しています。

ドリコエクタ症(または大血管拡張症)では、血管の弾力性の低下が観察され、その結果、血管が形態学的に変化し、その結果、血管が機能不全 に陥り9、脳内の血流が減少する。この血流の減少は、その後、酸素とグルコースの供給を減少させ、最終的には反応性アストロサイトの活性化を通じてBBBに損傷を与える10。ドリコエクスターゼ11により血管の内部エラスチン層が損傷を受けた場合、血管新生には血管内皮増殖因子(VEGF)の刺激を繰り返す必要がある。これは、漏れやすい血管の形成につながり、最終的には、欠陥のある血管の発達を特徴とする病理学的血管新生をもたらす可能性がある12。病的な血管新生では、血管が欠損すると、タイトジャンクションタンパク質をアップレギュレーションすることにより血管の完全性を回復する代償メカニズムが現れます。しかし、このプロセスは、血管の構造的完全性が失われたときに、不注意でBBBを混乱させる可能性がある13。これは、BBBをさらに破壊し、アミロイドプラーク14の産生を促進することによって起こり得る。さらに、末梢からの漏出は神経炎症15を引き起こし、その結果、ニューロンの変性とそれに続く記憶喪失を引き起こす可能性がある。

構造的には、BBBが提供する保護は、生体異物が血液が脳に入るのを防ぐタイトジャンクションを介して行われます。特定の物質が脳に入るのを許すとき、BBBは主に受動的拡散、または特定のチャネル(イオンチャネルやトランスポーターなど)1の2つの主要なプロセスを通じてそれを行います。ADでは、機能不全の血管系が状態の進行に重要な役割を果たしていることが研究で実証されています12,13。アミロイドβ(Aβ)プラークの形成と神経変性は、BBBの破壊12,13と脳血流の乱れ16から生じる可能性がある。脳血流の減少は、血管性認知症と診断された高齢者とAD17,18で見られます。機能不全の脳血流(CBF)とともに血液脳関門(BBB)の損傷は、末梢循環からの異物の浸潤を伴う脳内のAβ濃度の産生の増加に寄与する可能性があります19

ADや血管性認知症(VaD)などの神経疾患の病因を調査するために、疾患を再現するモデルが開発されています。in vitroモデルは広く使用されていますが、混合細胞集団のような広範な疾患モデリングのための生物学的環境が不足しているため、in vivoモデルの重要性が必要です。マウスは、疾患においてヒトのような特性(例えば、病理学)を生成する際の遺伝子操作の容易さのために一般的に使用されます。これまでの進歩に伴い、大血管拡張などの疾患表現型やADにおけるその役割を模倣するための改良モデルが引き続き必要とされています。この目的のために、私たちは機会を見出し、マウスのCisterna magnaにエラスターゼを注入することを含む技術を変更しました20,21。エラスターゼは、結合組織22および周囲のタイトジャンクション23でエラスチンを分解することが示されている酵素である。大槽は、脳内で最大の血管であるウィリスの円の真上に位置しているため、注射点として選択されました。大槽にエラスターゼを注入することにより、タイトジャンクションを破壊し、血管の拡張を誘発することにより、BBBと血管を損なうことができます(ウィリスの円)24,25。この手法を病理学のADマウスモデルの使用と組み合わせることで、ADの血管成分の病因の理解を深めることで、これら2つの異なる病状間の複雑な相互作用と影響に関する貴重な洞察を得ることができます。

以前の研究では、患者がADとVaDの両方の病理学的特徴を示す例が実証されており、この状態は一般に混合型認知症と呼ばれます26,27。したがって、両方の状態間の相互に関連するメカニズムを理解することは、これらの神経変性疾患の進行と発現についてより包括的な視点を提供し、根本的なメカニズムと潜在的な治療戦略の理解を深めることができます。この目的のために、AD病理マウスモデル(AppNL-F)でのエラスターゼの適用を示し、血管の変化を特定します。

Protocol

この研究では、生理学的レベルでヒトアミロイドプラークを発現するAppNL-Fマウス(3か月齢)を使用しましたが、このシステムは任意のげっ歯類モデルで使用できます。すべての動物処置は、CAMHの動物管理委員会(プロトコル#843)によって承認され、カナダ動物管理評議会のガイドラインの倫理基準に準拠していました。マウスは社内で飼育され、12時間の明暗サイクルで飼育され、チャウと水に 自由 にアクセスできます。 1. 大槽(CM)注射の手順 手術マウス(APPNL-F、雌雄、3ヶ月)を麻酔導入チャンバーに1分間置きます。注:5%イソフルランと1%酸素を混合した状態でチャンバーを少なくとも1分間洗い流します。 マウスに麻酔をかけた後、動物をチャンバーから取り出し、新しい外科用ドレープの上に置き、鼻のコーンを鼻の上に置いて麻酔(イソフルラン、2.5%-3%)を維持します。注:つま先をつまんで麻酔の深さを確認し、反射神経がないことを確認します。 乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。その後、切開部位に0.1mLのブピバカイン(局所麻酔薬;1-2mg/kg 0.125%、希釈比1:2)とメタカム(鎮痛薬;5mg/kg、希釈比1:10)を皮下注射します。手術中の潜在的な失血を補うために、手順を行う前に0.5mLの生理食塩水を皮下に注射して動物を水分補給してください。 明確な切開部位を得るには、後頭骨の基部で首を剃り、滅菌PBSで表面を拭き取り、腹臥位で被験者を定位固定装置フレームに移します。注意: 麻酔が定位固定装置の鼻円錐を通して維持されていることを確認してください。 定位固定装置フレームのノーズバーをマウスの上に置き、安定性を確保し、上の歯が固定されるようにします。 動物の頭部を体から120°の角度で配置して、うなじを持ち上げたり広げたりして、関心のある手術領域を露出させます。 ベタジンスクラブ3x、70%エタノール3x、およびベタジン溶液1xで手術部位を滅菌2インチx2インチのガーゼで洗浄します。 ピンセットを使って皮膚をやさしく折り、手術用ハサミで小さな切開(1cm)をします。注:これにより、首のうなじの正中線が明らかになるはずです。 メスを正中線に沿って慎重に動かし、筋肉を切り裂きます。次に、ピンセットを使用して、筋肉を左右に引き離すことで筋肉を優しく分離します。注:これにより、頭蓋骨の基部の下にあるCisterna magna(逆三角形)が見えるはずです(図1)。 エラスターゼの調製注:注文されたエラスターゼ(粉末状)のパッケージには、250ユニット(U)が含まれていました。各動物に注入するエラスターゼの量は2.5μLです。2.5 μLに含まれると想定されるエラスターゼの量は、15 milliUnits mUである必要があります。まず、注入する溶液の濃度を計算します。濃度=質量/体積= 15 mU/2.5 μL= 6 mU/μLしたがって、必要な濃度は6 mU /μLです。 エラスターゼの量は 250 U で、スタディは milliUnits で動作するため、単位を milliUnits に変換すると 250000 mU が得られます。 質量が250000 mU、濃度が6 mU/uLになった後、エラスターゼを希釈して6 mU/uLの濃度を維持する必要がある容量(PBS)を計算します。 上記と同じ式を使用して、体積を解くように並べ替えます。ボリューム=質量/コンク。= 250000 mU / 6 mU /μL= 41666.67 μL 41666.67μLはピペットで動かすのが難しいので、単純に1000で割ってミリリットルに換算すると41.66667mLになり、1x溶液が得られます。溶液をより濃縮するには、10倍または100倍に増やします。 10xソリューションを作成するのは、作業が簡単だからです(下記参照)。10倍溶液 ———- 4.166667 mL (濃度) 250Uを5 mLのアリコートチューブに入れ、4.167 mLの滅菌PBSをアリコートチューブに加えて、10倍ストック溶液を調製します。 10 μLの原液をピペットで移し、100本のアリコートチューブに入れると、4.167 mLの原液1000 μLが得られます。チューブは-20°Cで保管してください。 残りのストック溶液は、チューブあたり100 μLのアリコートチューブに保管し、-20°Cの冷凍庫で保存します。注:溶液は-20°Cで最大6か月間安定しており、活性を大幅に損なうことはありません。さらに、エラスターゼの過度の凍結融解は安定性を低下させる可能性があることに注意することが重要です。したがって、それが起こらないようにするために、凍結する前にストック溶液を分割して、一度に1つのサンプルを解凍して注入する必要があるようにすることができます。 10 μLの10倍溶液を含むアリコートチューブの1つを解凍した後、90 μLの滅菌PBSを加えて100 μL 1x溶液を得ます。 100μLの10x溶液が入った分注チューブを解凍した場合は、900μLのPBSを加えるだけで1000μL(1x溶液)が得られます。いずれの溶液も4°Cで1週間保存してください。 Cisterna magnaへの注入注意: エラスターゼをロードする前に、蒸留水5倍、エタノール5倍、最後に蒸留水5倍をロードして吸引することにより、ハミルトンシリンジを清掃します。ハミルトンシリンジに2.5μLのエラスターゼ(濃度15 mU)をロードし、気泡がないことを確認します。. ベベルを上に向けてシリンジをシスターナマグナの中央にゆっくりと挿入します。注:大槽を横切る血管に穴を開けないでください。 穿刺後、ベベルを取り外します。これにより、少量の脳脊髄液(CSF)の放出が促進されます。滅菌綿棒を使用して、余分なCSFを吸収します。 ベベルを穿刺部位に再挿入し、エラスターゼまたはビヒクルをシスターナマグナに1分以上ゆっくりと注入し、エラスターゼの漏れを防ぐために針を1分間そのままにします。 斜角を取り外した後、非吸収性の外科用縫合糸(#4-0と3/8インチの針)で切開部位を閉じ、麻酔薬をオフにします。 動物を定位固定装置フレームから取り外し、被験者が回復するまで37°Cに設定された温かいヒートパッドに置きます。注:術後の回復中の痛みを助けるために、手術後にMetacamの別の投与が推奨されます。. 2.シリコーンゴムコンパウンドの注入と組織の収穫 アベルチン(1 mL、125-250 mg / kg)の過剰摂取で動物に麻酔をかけます。.注意: つま先をつまんで反射が止まるようにします。 動物をおむつの上に置き、胸腔を上に向けてすべての手足をサージカルテープで固定します ピンセットとはさみを使用して胸腔を開き、心臓を露出させます。 23 Gの鈍い針を心臓の左心室に挿入し、ヘパリン(100 U / mL)を注入したPBSで4分間灌流し、マイクロ灌流ポンプを使用して血管をきれいにします。. バッファーボトルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)(PBSで構成)が入ったものと交換し、さらに4分間灌流します。 シリコーンゴムコンパウンド(黄色)溶液を調製するには、50 mLチューブに5 mLのコンパウンドと5 mLの希釈剤を混ぜ合わせます。よく混ぜてからご使用ください。 10 mLシリンジに10 mLのシリコーンゴムコンポと10 mLを入れます。.23Gの鈍い針に接続されたホースにシリンジを取り付け、手動で溶液を心臓に慎重に注入します。注:シリコーンゴムコンパウンドの粘度が高いため、より大きなバレルシリンジを使用することが重要です。そうしないと、圧力が高すぎてプランジャーを押すことができません。 注射後にマウスの頭部を取り外し、4°Cで一晩保存し、シリコーンゴムコンパウンドを血管内で硬化させます。 翌日、マウスの頭蓋骨を静かに取り除き(できれば細いピンセットを使用)、脳を取り出し、室温(RT)で一晩4%PFAでインキュベートします。 PFAで24時間インキュベートした後、脳をPBS 3xで洗浄し、30%スクロースに入れ、4°Cで保存します。 3. 定量分析 脳全体でCircle of Willisの高品質な画像を撮影するには(図3):スクロース溶液から脳を取り出します。ペーパータオルを使用して脳を完全に乾かし、表面の水分を逃がします。 脳を脳スライサーに配置します。ブレインスライサーをカメラ付きの光学顕微鏡の下に置きます。 顕微鏡の焦点をWillisのサークルの鮮明で高解像度の解像度に焦点を合わせます。 10cmの定規リファレンスを備えた画像解析ソフトウェアを使用して、約1cmを測定し、ピクセル数を記録します。この測定値に基づいて1cmの目盛りを設定し、脳底動脈の厚さを水平に測定して直径を求めます。 標準のピクセルデンシトメトリーソフトウェアを使用して、画像を解析します。画像解析ソフトウェアを使用して脳底動脈の5つの別々の測定値を(センチメートル単位)測定し、平均を計算して脳底動脈の直径を正確に表します。 二元配置分散分析(ANOVA)を使用して、エラスターゼと対照群の間の直径の平均変化を比較します。21未満の式を使用して、直径の変化率を計算します。C = 相対的変化X1 = 初期値 (車両)X2 = 最終値 (エラスターゼ)P値が0.05未満を統計的に有意とみなします。統計分析ソフトウェアを使用して、すべての統計分析を実行します。 4. アルコール脱水によるシリコーンゴムコンパウンドの除去 注:免疫染色の品質を向上させる可能性のある血管からの余分なシリコーンゴム化合物を取り除くために、脳を脱水することが重要です。 脳をPBSで3回洗って、スクロースを取り除きます。 脳を25%、50%、75%、95%、および無水エタノールに各濃度で24時間、合計5日間置きます。 組織の脱水後、組織をサリチル酸メチル(濃度≤100%)に12〜24時間置きます。エタノールとサリチル酸メチルは、組織内の余分なシリコーンの除去を可能にします。 PBS 3xで脳を洗浄して残留化学物質を取り除き、新鮮なPBSのロッカーで4°Cに一晩放置します。 脳をスクロースに入れ、切片化および免疫染色の前に4°Cで保存します。 5. 免疫組織化学染色 脳の切片化免疫切片の前に、スクロースで満たされたチューブの底に脳が落ち着くのを待ちます。 ドライアイスに囲まれた最適な切断温度(OCT)化合物を使用して、ミクロトームプラットフォーム上で脳を凍結します。ミクロトームブレードを使用して脳を40μmの切片にスライスします。 各切片を凍結防止剤を含む96ウェルプレートに移し、細い先端のペイントブラシを使用して凍結を防ぎます。 96ウェルプレートをラップでしっかりと密封します。密封されたプレートは-20°Cの冷凍庫に保管してください。 免疫蛍光染色(NeuNを例に)切片を24ウェルプレートに入れます。PBSで3回の洗浄を行い、凍結保護剤を排除します。 非特異的結合を防ぐため、2%ヤギ血清、0.1%Triton-X 100、および1%BSAを含むブロッキング溶液を用いて、RTで1時間インキュベートしてください。 すべてのコンポーネントをPBSで準備します。注:使用した一次抗体には、1:500希釈のモノクローナルマウス抗NeuNが含まれていました。使用した二次抗体には、1:200に希釈したポリクローナルヤギ抗マウス568が含まれていました。 モノクローナルマウス抗NeuNを上記のブロッキング溶液で希釈します。 希釈した抗体を各ウェルに加えます。ホイルで光から遮蔽し、4°Cで一晩インキュベートします。 一次インキュベーション後、切片をPBSで3回洗浄します。ポリクローナルヤギ抗マウス568を同じブロッキング溶液で希釈します。 希釈した抗体を各ウェルに加えます。箔で光から遮蔽し、室温で2時間インキュベートします。 二次インキュベーション後、切片をPBSで3回洗浄します。 細い絵筆を使用して、セクションをスライドにゆっくりと移すことにより、取り付けの準備をします。すべてのセクションを乾かします。 切片が乾燥したら、125-150μLの退色防止封入剤を塗布します。カバースリップをそっと置きます。 スライドを暗闇のRTで24時間乾燥させ、マニキュアで端をシールします。イメージングソフトウェアを使用して蛍光画像をキャプチャします。

Representative Results

マウスを脳定位フレームに慎重に配置し、筋肉を解剖した後、頭蓋骨の後頭部の下に大槽を見つけることに成功しました。この解剖学的構造は、逆三角形に似ており、黄色で強調表示されており、頭蓋骨の基部の下に位置しています(図1)。精度を確保し、脳組織への損傷を防ぐために、ハミルトンシリンジベベルの1〜2mmをシスターナマグナに優しく挿入しました。 <…

Discussion

この記事では、脳血管拡張のための改善されたプロトコルを示し、マウスの槽マグナへのエラスターゼ注射のための正確で簡単なアプローチを提供します。この解剖学的ポイントは、脳脊髄液への直接の入り口として機能し、さまざまな神経疾患の調査に貴重な手段を提供します。この修正された技術の主な利点の1つは、マウスの大槽にエラスターゼを単回投与で注入すると、反復可能な注…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、手術の支援に協力したステファニー・タムの貴重な貢献によって可能になりました。これもひとえに心より感謝申し上げます。この研究を支援してくれた国立衛生研究所(AG066162)。

Materials

23 G catheter University Medstore 2546-CABD305145 Needed for perfusion  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Absolute ethanol University Medstore https://www.uoftmedstore.com/index.sz For removing the microfil
Betadine scrub # https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub Sterilization
Betadine solution Amazon https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW Sterilization
Bupivacaine Provided by animal facility N/A Analgesic
Clippers BrainTree Scientific Inc CLP-41590 Shave fur
Cotton Q-tip University Medstore 1962 For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Elastase Sigma-aldrich  E7885 Used for the dilatation of blood vessel
Ethanol University Medstore 39752-P016-EAAN Sterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Goat anti-mouse 568 Invitrogen A11004 For staining mature neurons
Graphpad prism 10 Graphpad prism 10 https://www.graphpad.com/ Statistical analysis software
Hamilton syringe Sigma-aldrich 28614-U Injection elastase
Heat pad Amazon https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ Maintain body temperature
ImageJ software Fiji Imagej software imagej.net (USA) Image analysis software
Induction chamber Provided by animal facility N/A Anesthesia induction
Metacam Provided by animal facility N/A Analgesic
Methyl salicylate Sigma-aldrich M6752 For removing the microfil
Microfil Flow Tech, Carver, Massachusetts https://www.flowtech-inc.com/order/  Dye (yellow)
Mouse monoclonal anti-NeuN Millipore Sigma MAB377 For staining mature neurons
Olympus VS200 slide scanner and VSI software. Olympus Life Science https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104 Imaging software
Paraformaldehyde University Medstore PAR070.1 For protein fixation  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Perfusion pump VWR International https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps Needed for perfusion
Scalpel University Medstore 2580-M90-10 For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Stereotaxic Provided by animal facility N/A So secure the animal for surgery
Surgical scissor University Medstore 22751-A9-240 For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Surgical tape University Medstore https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2 Secure the animal on the diaper
Sutures University Medstore 2297-VS881 For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
X2 tweezers University Medstore 7731-A10-612 For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)

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記事を引用
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