概要

疾患進行を模倣し薬物活性を予測する非小細胞肺癌の同所性異種移植モデルの構築

Published: May 10, 2024
doi:

概要

この研究は、蛍光A549-iRFP細胞の多細胞スフェロイドの肺内接種に基づく同所性非小細胞肺がん(NSCLC)モデルを示しています。このモデルは、長波長蛍光の動的 in vivo モニタリングに従って、臨床NSCLC病期を再現し、シスプラチンに応答します。

Abstract

非小細胞肺がん(NSCLC)は、複雑で不均一な腫瘍微小環境を伴う致死性の高い疾患です。現在、がん細胞懸濁液の皮下接種に基づく一般的な動物モデルは、NSCLCの腫瘍微小環境を再現していません。ここでは、三次元多細胞スフェロイド(MCS)の肺内接種を採用したマウスの同所性肺がん異種移植モデルについて説明します。具体的には、蛍光ヒトNSCLC細胞(A549-iRFP)を低付着96ウェルマイクロプレートでコラーゲンと共に3週間培養してMCSを形成し、これを胸腺ヌードマウスの左肺に肋間接種して同所性肺がんモデルを確立しました。

A549-iRFP細胞株のMCSは、元のA549細胞株と比較して、抗がん剤に対して同様の反応を示しました。A549-iRFP細胞の長波長蛍光シグナルは、スフェロイド体積、細胞生存率、細胞タンパク質レベルなど、がん細胞増殖の一般的なマーカーと強く相関していたため、蛍光イメージングによる in vivo でのがん増殖の動的モニタリングが可能になりました。マウスへの接種後、A549-iRFP MCS異種移植片は、原発腫瘍の拡大、隣接する二次腫瘍の出現、対側右肺および遠隔臓器へのがん細胞の転移など、NSCLCの臨床病期によく似た段階を経て確実に進行しました。さらに、このモデルは、ベンチマークとなる抗肺がん治療薬であるシスプラチンに反応し、予想される毒性とがんの進行が遅いことが示されました。したがって、このNSCLCのマウス同所性異種移植モデルは、疾患の進行を再現し、潜在的な抗がん剤の開発を促進するためのプラットフォームとして機能します。

Introduction

すべての腫瘍性疾患の中で、肺がんは最も多くの生命損失をもたらすだけでなく、米国で毎年2番目に多い新規患者数を主張しています1。この壊滅的な悪性腫瘍は、現代医療における大きな障害となっており、その複雑な生物学とより効果的な治療法のより深い理解が求められています2。非小細胞肺がん(NSCLC)は肺がんの85%を占め、固形腫瘍に発展する傾向があります3。肺がんにおける最も重要な課題の1つは、動的で不均一な腫瘍微小環境であり、これはがんの進行と治療介入に対する反応に深く影響します4,5,6。NSCLCのさまざまな段階におけるがん細胞とその微小環境との相互作用をより深く理解するには、NSCLC進行の組織学的特徴を再現する洗練された病理学的モデルが必要です。

この点で、同所性動物モデルは、NSCLC研究の有望な手段として浮上しています。一般的に採用されている皮下異種移植モデル7とは異なり、同所性モデルは、起源の臓器に直接接種されるがん細胞を特徴としています。肺がんの場合、これはがん細胞を直接肺組織に移植することを意味する8,9。その結果、肺がんの同所性モデルは、隣接する組織、血管、免疫成分を含む天然の腫瘍微小環境をよりよく模倣し、それらの生理学的および臨床的関連性を向上させます。

三次元多細胞スフェロイド(MCS)は、腫瘍環境の特徴を再現するための別の有望なアプローチを表しています。ほとんどのがんは、さまざまな細胞間相互作用、細胞外マトリックス、酸素と栄養素の勾配など、複雑な腫瘍微小環境によって特徴付けられます10,11。従来の2D細胞培養には、これらの腫瘍特異的な特徴を再現するための空間的および構造的な複雑さが欠けています12。対照的に、適切なサイズのMCSは、低酸素および壊死性のコアを持つ不均一な構造を特徴としており、これは腫瘍内の微小環境だけでなく、抗がん療法における薬剤耐性の主要なメカニズムである薬物浸透に対する生理学的障壁も再現しています13,14,15。

同所性動物モデルとMCS培養技術の両方を利用して、MCSは免疫不全マウスに接種され、乳癌および前立腺癌の同所性モデルの構築に成功しました16,17。ここでは、肺がんのマウス同所異種移植モデルを構築および特徴付けるための詳細な方法論を報告します。この方法は、蛍光ヒト肺がん細胞(A549-iRFP)18に由来する3D MCSの肺内接種を採用しています。このモデルは、NSCLCの4つの臨床病期と密接に並行する病期を通じて肺がんのin vivo進行を観察する絶好の機会を提供します。さらに、このモデルの異種移植癌は、臨床的に確立された抗肺癌薬であるシスプラチンに応答しました。

Protocol

動物実験は、太平洋大学の動物管理・使用委員会(IACUC)の承認を得て実施されました(動物プロトコル19R10および22R10)。本研究では、体重 5 〜 6 週齢、体重 20 〜 25 g の 8 匹の雄の胸腺ヌード マウスを、参照されたげっ歯類の餌で飼育し、病原体を含まない (SPF) 条件下で飼育しました。ケージ、寝具、飲料水はオートクレーブ滅菌され、定期的に交換されました。マウスでの腫瘍接種の概略図を…

Representative Results

A549-iRFP MCS の特性評価A549-iRFP MCSは、コラーゲンと遠心分離の助けを借りて、スフェロイドマイクロプレートでの培養に成功しました。MCSが1週間後に直径約500μmに達したとき、A549とA549-iRFP MCSの両方をさまざまな抗がん剤および製剤に3日間曝露した後、さらに4日間薬物フリー増殖培地で維持しました。A549-iRFP MCSは、親A549細胞の応答パターンと密接に類似した応答パターンを示…

Discussion

A549-iRFP MCSの構築は、簡単で再現性の高いラボ手順であり、複数の細胞株のMCS形成に変換することができます。遠心分離とコラーゲンの助けを借りて生成されたMCSは、3〜4日以内により一体的で固形腫瘍のような構造を示します。この方法により、堅牢なスフェロイドが形成され、その一体構造を長期間、通常は2〜3週間、または小さな出芽が出現し始めるまでさらに長く維持できます。遠心?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、パシフィック大学からのSAAGおよびSEED助成金によって支援されました。Odyssey Infrared Imaging 205 システムへのアクセスを許可してくださった William Chan 博士と、SpectraMax iD3 プレートリーダーへのアクセスを許可してくださった John Livesey 博士に感謝します。動物プロトコルに関する技術的なアドバイスをいただいたメラニー・フェルムリー博士に感謝します。

Materials

100 µL Glass Syringe Hamilton Part/REF #80601
20 G Needle Thermo Fisher Scientific Inc. 14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate  Corning 15-100-173
A549-iRFP Imanis Life Sciences  CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet  Research Diets, Inc. D10012M
Athymic Nude Mouse Charles River Laboratories, Inc. Strain Code: 490; homozygous
BCA Pierce 23227
Buprenorphine Hydrochloride Patterson Veterinary NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9683
Collagen Gibco A1064401 
DMEM Corning MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva HyClone SH3039603
ImageJ Open source tool (https://imagej.net/ij/) N/A
Image Studio  LI-COR Version 5.2
Isoflurane Patterson Veterinary NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine Patterson Veterinary NDC Number: 50989-0161-06
Microscope  Keyence Model number: BZ-X710
Matrigel Corning CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System  LI-COR Model number: 9140
PBS Corning MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system  LI-COR Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin  Corning MT30002CI
Puromycin Thermo Fisher Scientific Inc. AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB  Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/) N/A
Surgical Clips–AutoClip System Fine Science Tools 12020-00
Xylazine Patterson Veterinary NDC Number: 61133-6017-01

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記事を引用
Xu, Z., Huang, Y., Zhu, Y., Pei, X., Lu, Y., Zhao, S., Guo, X. Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities. J. Vis. Exp. (207), e66787, doi:10.3791/66787 (2024).

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