概要

ヒト筋肉間脂肪組織からの核の単離と下流の単一核RNAシーケンシング

Published: May 03, 2024
doi:

概要

筋肉間脂肪組織(IMAT)の生物学は、ヒト組織のアクセス性が限られているため、ほとんど未踏です。ここでは、このユニークな脂肪貯蔵庫の細胞組成を特定するための単一核RNAシーケンシングのための凍結ヒトIMATの核単離とライブラリ調製のための詳細なプロトコルを紹介します。

Abstract

筋肉間脂肪組織(IMAT)は、筋繊維の間に位置する比較的研究されていない脂肪貯蔵庫です。IMAT含有量は、年齢とBMIとともに増加し、代謝性疾患および筋肉変性疾患に関連しています。しかし、IMATの生物学的特性と周囲の筋線維との相互作用についての理解は著しく不足しています。近年、シングルセルおよび核RNAシーケンシングにより、いくつかのヒト組織の細胞タイプ特異的なアトラスが得られました。しかし、ヒトIMATの細胞組成は、ヒトの生検収集からのアクセス可能性に固有の課題のために、ほとんど調査されていないままです。ヒトIMATは、採取される組織の量が限られていることに加え、骨格筋組織や筋膜に近いため、処理が複雑になります。脂肪細胞の脂質を多く含む性質により、脂肪細胞は単一細胞の単離と互換性がありません。したがって、単一核RNAシーケンシングは、単一細胞分解能で高次元トランスクリプトミクスを得るのに最適であり、IMATの正確な細胞組成を含むこのデポの生物学を明らかにする可能性を提供します。ここでは、単一核RNAシーケンシングのための凍結ヒトIMATの核単離とライブラリ調製のための詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、液滴ベースのアプローチを使用して数千の核をプロファイリングできるため、希少で存在量が少ない細胞タイプを検出する能力が得られます。

Introduction

筋肉間脂肪組織(IMAT)は、筋線維1の間および周囲に存在する異所性脂肪貯蔵庫です。Goodpasterらによる最近のレビューで詳細に説明されているように、IMATは、高解像度のコンピュータ断層撮影法(CT)および磁気共鳴画像法(MRI)(図1AB)を使用して検出でき、全身の筋線維の周囲および内部に見られます1。IMATの量は個人によって大きく異なり、BMI、年齢、性別、人種、座りがちな状況に影響されます2,3,4。さらに、IMAT沈着は、筋肉の変性5に関連する病的状態によく見られ、多くの研究で、肥満、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、およびインスリン抵抗性6,7,8,9の個人におけるIMAT量の増加が記録されています。それにもかかわらず、IMATの細胞的および生物学的特性は解明され始めたばかりです。アクセス性が限られていること、IMATの位置と内容物が全身に異なることが、このユニークな脂肪貯蔵所2からのサンプル収集を困難にしています。さらに、サンプルは収集時に骨格筋(SM)で容易に「汚染」されるため、異なる組織からの生物学的寄与の分離を解読するのが困難になります(図1C)。そのため、過去10年間で大きな注目を集めている一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)は、IMATおよびSM由来の遺伝子発現パターンをシングルセルの分解能で分離するための理想的な方法論として機能します。さらに、核の単離は、脂質を多く含む脂肪細胞が大きいため、脂肪組織に特に有用であり、細胞の完全性を損なうことなく単一細胞懸濁液に解離することは不可能です。最後に、この技術は、IMAT特異的脂肪細胞の新規マーカーを発見し、異なる前駆細胞集団の組成と存在を明らかにするだけでなく、病理学的および正常な状態での細胞組成の変動を研究する可能性を秘めています。

Figure 1
図1:IMATの画像。 (A)中年の痩せた女性と(B)肥満の中年男性からのIMATの代表的な磁気共鳴(MRI)画像。赤:皮下脂肪組織、黄:筋肉間脂肪組織、緑:骨格筋、青:骨。画像提供:Heather Cornnell氏、AdventHealth Translational Research Institute。(C)IMATを使用した新鮮な組織サンプル(黒の破線で囲まれています)。画像提供:AdventHealth Translational Research Institute の Meghan Hopf 氏とコロラド大学の Bryan Bergman 氏。この図は、Goodpaster et al.1 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

豚、鶏、牛の肉の霜降り(特にIMAT)をシングルセル(sc)とsnRNA-seq10を用いて調査した畜産業界から多くの研究が発表されています。これらの研究により、脂肪細胞のいくつかの亜集団とIMATの潜在的な前駆細胞のマーカーが特定されました11,12,13;しかし、これらの細胞組成物がヒトIMATに翻訳されるかどうかは不明です。私たちの知る限り、変形性股関節症の男性患者から得られた、脂肪浸潤を伴うヒト筋肉の細胞の不均一性をsnRNA-seq14を使用して調べた研究は1つだけです。研究者らは、小さな脂肪細胞集団といくつかの線維脂肪形成前駆細胞(FAP)亜集団を報告しました 筋核14の大規模な集団内。私たちの研究は、snRNA-seqを使用して、ヒトの筋肉から手動で解剖したIMATの細胞組成を直接調べる方法を開発した最初の研究です。

重要なことは、snRNA-seqのプロトコールは、利用可能な組織の量と特定の組織の物理的特性によって最適な処理ステップが決まるため、研究対象の特定の組織に合わせてカスタマイズする必要があるということです。IMATの組織収量は通常小さく、超音波ガイド下生検を行う場合でも、50 mgを超えないことがよくあります。したがって、この希少な組織の適切な処理が不可欠です。このプロトコルは、ヒトIMATを研究する研究者にとって貴重なリソースとなると考えています。

Protocol

このプロトコルに使用されたサンプルは、Western IRB-Copernicus Group(WCG)の治験審査委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施されたStudy of Muscle Mobility, and Aging(SOMMA)15の一部でした。参加者は、研究への参加について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 注:このプロトコルは、ナノウェルベースのプラットフォーム<sup c…

Representative Results

このワークフローは、凍結ヒトIMATサンプルの処理をガイドして、単一核の分解能で遺伝子発現プロファイルを取得し、細胞タイプの同定を可能にするように設計されています。ここでは、SOMMA試験の参加者から代表的なIMATサンプルを1つ紹介します。 snRNA-seqデータの解析の最初のステップは、データの品質を評価して、データセットから削除する必要がある可能性のある…

Discussion

IMATとの連携には、いくつかの固有の課題があります。その限られたアクセス性に加えて、サンプル材料の収量は非常に少ないことが多く、骨格筋の「汚染」を避けることはほとんど不可能です。最高品質のサンプルを得るためには、生検針を挿入する際に筋筋膜を貫通し(皮下脂肪組織を採取しないようにするため)、採取後すぐに顕微鏡でサンプルを解剖してできるだけ多くの筋肉組織を切?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、コロラド大学のBryan Bergman博士が、MoTrIMAT研究(R01AG077956)の図1CのIMAT生検の画像を提供してくれたことに感謝の意を表します。私たちは、代表的な結果セクションにデータが示されているIMATサンプルを提供した筋肉、可動性、老化の研究に感謝しています。国立老化研究所(NIA)は、筋肉、可動性、老化の研究(SOMMA;R01AG059416)およびその補助的な研究SOMMA AT(R01AG066474)およびSOMMA Knee OA(R01AG070647)。研究インフラストラクチャのサポートは、ピッツバーグ大学(P30AG024827)とウェイクフォレスト大学(P30AG021332)のNIAクロード・D・ペッパー高齢者アメリカ独立センターと、ウェイクフォレスト大学の国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(UL1 0TR001420)が資金提供した臨床およびトランスレーショナルサイエンス研究所によって部分的に資金提供されました。

Materials

0.2 µm corning syringe filters  Millipore Sigma CLS431229
1.7 mL DNA LoBind tubes Eppendorf 22431021 low-bind tubes
10% Tween 20 Bio-Rad 1662404
100x protease inhibitor Thermo Fisher Scientific 78437
10X Magnetic Separator 10X Genomics 230003
10X Vortex Adapter 10X Genomics 330002
15 mL canonical tubes Sarstedt 6,25,54,502
2100 Bioanalyzer  Agilent G2939BA
50 mL conical tubes Sarstedt 6,25,47,254
CellRanger Genomics N/A
Chromium iX accesory kit 10X Genomics PN1000323
Chromium iX Controller 10X Genomics PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit  10X Genomics PN1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3'  Kit v 3.1 10X Genomics PN1000269
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1  10X Genomics PN1000129
Chromium Next GEM Single Cell GEM Kit v3.1 10X Genomics PN1000130
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX2000 Automated cell counter
Countess cell counting chamber slides Thermo Fisher Scientific C10228
DoubletFinder N/A
DPBS (no calcium, no magnesium) Thermo Fisher Scientific 14190144
DTT Thermo Fisher Scientific R0861
Dual Index Kit TT Set A, 96 rxns 10X Genomics PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE  10X Genomics PN2000048
Falcon 100 µm Cell strainer Corning Life Science 352360
Falcon 40 µm Cell strainer Corning Life Science 352340
Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution Ricca Chemical Company 3290-32
KCL Thermo Fisher Scientific AM9640G
Library Construction Kit v3.1 10X Genomics PN1000196
MACS SmartStrainers (30µm) Miltenyi Biotec 130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Thermal cycler Eppendorf 6331000017
MgCl2 Ambion AM9530G
Mortar and pestel Health care logistics  14075
NucBlue Live Ready Probes Reagent Thermo Fisher Scientific R37605
Nuclease Free Water (not DEPC treated) Thermo Fisher Scientific AM9930
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder Sigma-Aldrich 820024
Qiagen Buffer EB Qiagen 19086
Ribolock RNAse inhibitor Thermo Fisher Scientific EO0382
Seurat N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SUPERasin 20 U/µL Thermo Fisher Scientific AM2695
ThermoMixer C Eppendorf  5382000015
Tissue homogenizer Glass-Col 099C K54
Tris buffer pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9855G
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific AC327372500
UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0 Gibco 15575020

参考文献

  1. Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health. Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).
  3. Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue. Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).
  4. Manini, T. M., et al. Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults. Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).
  5. Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular fat: A review of the consequences and causes. Int J Endocrinol. 2014, 309570 (2014).
  6. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).
  7. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).
  8. Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  9. Sachs, S., et al. Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).
  10. Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle. Biology (Basel). 12 (10), 1289 (2023).
  11. Wang, L., et al. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 7 (1), 23 (2023).
  12. Li, J., et al. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 752 (2020).
  13. Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells. Front Genet. 12, 742077 (2021).
  14. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 6 (1), 111 (2023).
  15. Cummings, S. R., et al. The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).
  16. Whytock, K. L., et al. Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling. STAR Protoc. 4 (1), 102054 (2023).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE Available from: https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf (2022)
  18. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).
  19. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).
  20. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).
  21. Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (2), 57 (2020).
  22. Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics Available from: https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data (2022)
  23. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746 (2019).
  24. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  25. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  26. Whytock, K. L., et al. Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations. iScience. 25 (8), 104772 (2022).
  27. Probst, V., et al. Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols. BMC Genomics. 23 (1), 860 (2022).
  28. CG000148 Rev A Technical Note – Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics Available from: https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb (2018)
  29. Gupta, A., et al. Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages. Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).
  30. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648 (2018).
  31. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
  32. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -. A., Lee, H. -. O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  33. Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 11 (1), 5650 (2020).

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記事を引用
Elingaard-Larsen, L. O., Whytock, K. L., Divoux, A., Hopf, M., Kershaw, E. E., Justice, J. N., Goodpaster, B. H., Lane, N. E., Sparks, L. M. Isolation of Nuclei from Human Intermuscular Adipose Tissue and Downstream Single-Nuclei RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (207), e66784, doi:10.3791/66784 (2024).

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