概要

シングルセルRNAシーケンシングのためのヒトおよびマウス腫瘍組織サンプルの解離

Published: August 16, 2024
doi:

概要

このプロトコルは、シングルセルRNAシーケンシングのためにヒトとマウスの腫瘍サンプルを迅速に解離する手順を概説しています。

Abstract

ヒト腫瘍サンプルは、その微小環境と免疫レパートリーに関する大量の情報を保持しています。ヒト組織サンプルを生存細胞懸濁液に効果的に解離させることは、シングルセルRNAシーケンシング(scRNAseq)パイプラインに必要なインプットです。バルクRNAシーケンシングアプローチとは異なり、scRNAseqは、腫瘍標本の転写不均一性をシングルセルレベルで推測することができます。近年、このアプローチを取り入れることで、免疫細胞や腫瘍細胞の状態、免疫療法などの治療に対する臨床反応に関連するプログラムの同定など、多くの発見が生まれています。さらに、解離組織に適用されたシングルセル技術を使用して、DNAバーコード抗体(CITEseq)を使用して、アクセス可能なクロマチン領域T細胞およびB細胞受容体レパートリー、およびタンパク質の発現を同定できます。

これらの技術を使用する際には、解離したサンプルの生存率と品質が重要な変数であり、これらは単一細胞と周囲のRNAとの交差汚染、データの品質、および解釈に劇的な影響を与える可能性があります。さらに、長時間の解離プロトコルは、敏感な細胞集団の排除とストレス応答遺伝子シグネチャのアップレギュレーションにつながる可能性があります。これらの制限を克服するために、私たちは迅速な普遍的な解離プロトコルを考案し、これは複数のタイプのヒトおよびマウス腫瘍で検証されています。このプロセスは、機械的および酵素的解離から始まり、ろ過、赤血球溶解、および細胞のインプットが少ないサンプル(針コア生検など)に適した生死濃縮が続きます。このプロトコールは、ゲルビーズインエマルジョン(GEM)の正常な生成、バーコード化、およびシーケンシングにとって最も重要な、クリーンで生存可能なシングルセル懸濁液を保証します。

Introduction

がん研究の多くの進歩により、免疫細胞や腫瘍細胞に発現する阻害性受容体を標的とする薬剤(チェックポイント阻害薬として知られる)の開発とFDAの承認につながったが、治療抵抗性や患者の反応を促進するメカニズムの特定は依然として課題となっている1。腫瘍の不均一性をその分子多様性と腫瘍細胞と免疫微小環境との間の複雑な相互作用で特徴付けるという複雑な課題は、この複雑な生態系を単一細胞の分解能で解剖するための新しいアプローチを必要としています。腫瘍とその微小環境内の分子の複雑さを理解することは、治療戦略を進歩させ、がんの進行の根底にある複雑な生物学を解読するために極めて重要です2。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、複雑な腫瘍サンプル内の個々の細胞を高分解能で解析できるため、ますます人気が高まっています3,4

遺伝的、エピジェネティック、表現型の多様性を包含する腫瘍の不均一性は、がん生物学の複雑さを明らかにする上で課題を提起しています5。従来のバルクRNAシーケンシングの方法では、腫瘍内に存在する不均一な細胞集団のユニークな発現プロファイルと表現型が不明瞭になる傾向があります。これらの方法は、細胞集団全体のシグナルを平均化するためです4。対照的に、scRNA-seqは個々の細胞タイプの解剖を可能にし、多様な遺伝子発現、抑制パターン、および他の方法では見落とされていた細胞状態を明らかにする4,6。scRNA-seqの前提は、個々の細胞の遺伝的および分子的特徴を解読する能力にあり、新しいがん治療薬の発見に大きな期待が寄せられています7

腫瘍細胞とその周辺間質細胞および免疫細胞の遺伝子発現プロファイルを解読することにより、研究者は新しい治療標的を特定し、個々の患者に合わせた精密な遺伝子医療戦略を開発することができます6。さらに、腫瘍微小環境内の免疫レパトアを解剖することで、腫瘍細胞と免疫エフェクターの相互作用に関する重要な洞察が得られ、免疫療法的介入への道が開かれます3。臨床サンプルでのscRNAseqの使用が進歩しているにもかかわらず、処理ステップ中のいくつかの課題は、細胞のRNAの完全性、生存率、および生成されたデータの品質を損なう可能性があります。さらに、細胞生存率の低い組織をプロセッシングすると、個々の細胞のカプセル化中に生成される液滴中の周囲RNAレベルが上昇し、細胞タイプのクロスコンタミネーションや誤ったアノテーションが生じる可能性があります。一方、37°Cで長時間の解離プロトコルを実行すると、複数の細胞タイプでストレス応答遺伝子シグネチャーがアップレギュレーションされる可能性があります8,910.

このプロトコルで概説されている段階的な手順(図1A)は、腫瘍の迅速な機械的および酵素的解離から始まり、続いて、各腫瘍サンプルの生存率に応じて、死んだ細胞のろ過と除去が行われます。現在、この手順は、黒色腫11、結腸直腸12、頭頸部扁平上皮癌13、膵臓および肺 (未発表データ) 腫瘍サンプルで確認されています。これらの技術により、下流の分析に不可欠な高品質の生細胞懸濁液の生成が保証されます14。特に、合成されたRNAを欠いた赤血球を除去することは、サンプルを精製するために不可欠になります15。その後の細胞数の評価と死細胞の除去は、10x Genomics Gel bead-in Emulsion(GEM)の生成、バーコード化を成功させ、感受性の高い集団(好中球や上皮細胞など)の排除を危険にさらすことなく転写産物や配列決定された細胞の回収率を高めるための前提条件となります16。これらのステップは、腫瘍サンプル9,10内のシングルセル分解能解析の可能性を解き放ち、革新的な治療介入を推進するために必要な新しい遺伝子発現プロファイルと免疫シグネチャーを明らかにし、新たな腫瘍の脆弱性を特定するための基本です。

Protocol

この研究は、ヒト組織サンプリングに関するすべての機関ガイドラインに準拠していました。患者からインフォームドコンセントを受け取り、識別可能なサンプルデータを匿名化しました。手術室で検体を採取し、RPMI、生理食塩水、PBSのいずれかの溶液に入れ、病理部でがん性を確認した後、研究に使用します。指示されている場合を除き、すべてのステップは4°Cまたは氷上で実行する必?…

Representative Results

RPMIに懸濁した黒色腫生検を採取し、直ちに氷上に置いた。サンプルを420 μLのRPMIおよび消化酵素が入った1.5 mLの微量遠心チューブに移し、ハサミで細かく刻み、その後、37°Cの垂直配置サーマルミキサーで15分間酵素分解を行いました(図1)。分解後、サンプルを50 μmの滅菌使い捨てフィルターでろ過し、フィルターを新鮮なRPMIで洗浄して細胞収量を増やしました(<strong cl…

Discussion

このプロトコルでは、10x Genomicsマイクロ流体システムを使用して、ヒトまたはマウスの腫瘍サンプルを単一細胞懸濁液に解離させ、scRNAシーケンシングを行う方法について説明します。希少がんに由来することが多い組織や、進行中の臨床試験やマウス腫瘍の長期実験の一部である組織の処理では、サンプルをすべてのステップ間で最適かつ慎重に保存する必要があります。室温で長時間の?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、Adelson Medical Research Foundation(AMRF)、Melanoma Research Alliance(MRA)、およびU54CA224068の支援を受けました。 図 1図 4および図 5 は BioRender.com を使用して作成されました。

Materials

1x PBS Corning 21-040-CV
10 mL serological pipette Corning 357551
1000 μL low-retention pipette tips Rainin 30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips Rainin 30389218
1000 μL pipette tips Rainin 30389212
10x Magnetic Separator 10x Genomics 120250
15 mL conical tubes Corning 430052
2 mL aspirating pipette Corning 357558
20 μL low-retention pipette tips Rainin 30389226
20 μL pipette tips Rainin 30389225
200 μL low-retention pipette tips Rainin 30389240
200 μL pipette tips Rainin 30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish Falcon 353004
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-1
BD 1 mL syringe Becton, Dickinson and Company 3090659
Bright-Line Hemocytometer Hausser Scientific 551660
Calcium Chloride Solution Sigma Aldrich 2115-100ML
Cell Ranger  10x Genomics N/A https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter Bio-Rad 1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters Sysmex 04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters Sysmex 04-004-2327
Dead Cell removal Kit  Miltenyi Biotec 130-090-101 Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431021
EasySepTM Dead Cell Removal
(Annexin V) Kit
STEMCELL Technologies 17899 Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R Eppendorf 5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R Eppendorf 2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller Eppendorf EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384 Eppendorf EP5384000012
FBS Gibco 26140-079 Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors Fine Science Tools 14568-12
Leica Dmi1 Microscope Leica Microsystems 454793
LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ Rainin 17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ Rainin 17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ Rainin 17014392
Quadro MACS Magnet Miltenyi Biotec 130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x) Gibco 21870-076 Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips USA Scientific 1402-4700
Trypan blue stain 0.4% Thermo Fisher Scientific T10282
Tumor Dissociation Kit, Human Miltenyi Biotec 130-095-929 Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions:
Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640
Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640
Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse Miltenyi Biotec 130-096-730 Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions:
Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640
Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640
Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977-015 Store at 4 °C

参考文献

  1. Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805 (2022).
  2. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59 (2020).
  3. Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
  4. Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98 (2023).
  5. Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. 生物学. 12 (9), 1183 (2023).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077 (2023).
  8. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
  9. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688 (2022).
  10. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  11. Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404 (2019).
  12. Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752.e20 (2021).
  13. Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
  14. Al’Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
  15. Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
  16. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
  17. Fan, X. -. J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  18. LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818 (2020).
  19. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).
  20. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
  21. Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140 (2023).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  23. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227 (2019).

Play Video

記事を引用
Fang, J., Salinas, I., San Vicente, S., Zielinski, C., Sade-Feldman, M. Dissociation of Human and Mouse Tumor Tissue Samples for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (210), e66766, doi:10.3791/66766 (2024).

View Video