Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly <i>Bradysia (Sciara) coprophila</i>: A New/Old Emerging Model Organism

Susan  A. Gerbi

doi:10.3791/66751

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生物学

Manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori Bradysia (Sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66751

Susan A. Gerbi¹

¹Department of Molecular and Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

概要

Questo articolo descrive il mantenimento in laboratorio (compreso l’accoppiamento e l’alimentazione) della mosca dittera inferiore Bradysia (Sciara) coprophila.

Abstract

Le scorte di laboratorio della mosca dittera inferiore, Bradysia (Sciara) coprophila, sono state mantenute per oltre un secolo. I protocolli per il mantenimento in laboratorio di B. coprophila sono presentati qui. Questi protocolli saranno utili per il numero in rapida crescita di laboratori che studiano B. coprophila per trarre vantaggio dalle sue caratteristiche biologiche uniche, che includono (1) un fuso monopolare nella meiosi maschile I; (2) non disgiunzione della diade X nella meiosi maschile II; (3) imprinting cromosomico per distinguere gli omologhi materni da quelli paterni; (4) cromosomi a linea germinale limitata (L); (5) eliminazione cromosomica (cromosomi paterni nella meiosi maschile I; uno o due cromosomi X negli embrioni precoci; cromosomi L dal soma negli embrioni precoci); (6) determinazione del sesso da parte della madre (non c’è il cromosoma Y); e (7) amplificazione del DNA regolata dallo sviluppo nei loci del soffio del DNA nei cromosomi politenici delle ghiandole salivari larvali.

È ora possibile esplorare queste numerose caratteristiche uniche della meccanica cromosomica utilizzando i recenti progressi nel sequenziamento e nell’assemblaggio del genoma di B. coprophila e lo sviluppo di una metodologia di trasformazione per l’ingegneria genomica. La crescente comunità scientifica che utilizza B. coprophila per la ricerca trarrà beneficio dai protocolli qui descritti per l’accoppiamento delle mosche (marcatori fenotipici per le madri che avranno solo figli maschi o solo figlie; dettagli sull’accoppiamento di massa per esperimenti biochimici), il controllo della schiusa degli embrioni, l’alimentazione delle larve e altri commenti sul suo allevamento.

Introduction

Una comprensione completa dei principi biologici richiede lo studio di molti organismi diversi che abbracciano l’Albero della Vita. Sebbene una vasta gamma di organismi sia stata descritta fino alla fine del^{XIX secolo,} dalla metà del XX^{secolo gli} studi sperimentali si sono limitati a una manciata di meno di una dozzina di organismi modello. Con l’avvento dell’era genomica e l’obiettivo di sequenziare i genomi di tutte le specie nell’Albero della Vita¹, siamo ora in grado di espandere i tipi di organismi utilizzati per esperimenti di laboratorio e di sfruttare la loro diversità. Tale espansione di organismi modello emergenti per gli esperimenti ha un prerequisito per essere in grado di mantenerli in laboratorio. Qui, vengono descritti i protocolli per l’allevamento di uno di questi organismi modello emergenti, nuovo/vecchio.

La maggior parte della vita animale sulla Terra è rappresentata da quattro super-radiazioni di Insetti². All’interno degli Insetti sono presenti circa 158.000 specie di Ditteri (mosche vere)³, con circa 3000 specie della famiglia degli Sciaridae (moscerini dei funghi neri)⁴. La mosca della frutta Drosophila è la più studiata delle mosche dei Ditteri. La mosca dei Ditteri inferiori (Nematocera), Bradysia (precedentemente chiamata Sciara) coprophila, si è separata 200 milioni di anni fa da Drosophila, che è una mosca “Dittera superiore” (Brachycera). Pertanto, B. coprophila si trova in una posizione tassonomica favorevole per gli studi comparativi con D. melanogaster (Figura 1). Inoltre, B. coprophila ha molte caratteristiche biologiche uniche che meritano di essere studiate a sé ^5,6,7. Molte di queste caratteristiche disobbediscono alla regola della costanza del DNA in cui tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso contenuto di DNA. In B. coprophila, (i) il genoma paterno viene eliminato su un fuso monopolare nella meiosi maschile I; (ii) vi è una non disgiunzione della diade X nella meiosi maschile II; (iii) i cromosomi (L) limitati alla linea germinale sono eliminati dal soma; e (iv) uno o due cromosomi X vengono eliminati nell’embrione precoce a seconda del sesso dell’individuo. L’imprinting cromosomico per distinguere gli omologhi materni da quelli paterni è stato scoperto per la prima volta in B. coprophila ed è in gioco per molti di questi eventi di eliminazione cromosomica. Oltre all’eliminazione dei cromosomi, un altro bypass della costanza del DNA si verifica attraverso l’amplificazione del DNA locus-specifica regolata dallo sviluppo nei loci del soffio del DNA nei cromosomi politenici delle ghiandole salivari larvali. Gli studi su queste caratteristiche uniche richiedono il mantenimento in laboratorio di B.coprophila; I dettagli del suo allevamento sono presentati qui per facilitare tali studi.

Figura 1: Filogenesi della bradisia (Sciara) coprophila. Gli organismi modello più diffusi sono indicati in carattere blu e il loro ordine tassonomico in carattere rosso. La bradisia e altri moscerini dei funghi sciaridi, così come le zanzare, sono mosche dei ditteri inferiori (in precedenza, sottordine Nematocera), mentre le specie di Drosophila sono mosche dei ditteri superiori (sottordine: Brachysera). Le informazioni sul lato sinistro della figura provengono da Misof et ^al.33; le informazioni sul lato destro provengono da Bertone et ^al.34 e Wiegmann et ^al.2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In precedenza, il genere Sciara aveva il maggior numero (700) di specie per qualsiasi eucariote, spingendo Steffan a suddividerle^{in 8}. Successivamente, Shin propose che la famiglia Sciaridae fosse suddivisa nella sottofamiglia Sciarinae (con sei generi tra cui Sciara, Trichosia e Leptosciarella), nella sottofamiglia Megalosphyinae (incluso il genere Bradysia) e in altri tre gruppi (tra cui Pseudolycoriella)⁹. La filogenesi degli Sciaridae è stata ulteriormente studiata da diversi gruppi negli ultimi anni ^9,10,11. Negli ultimi decenni, i nomi di molti organismi della famiglia Sciaridae sono cambiati¹². Sebbene la maggior parte della letteratura che copre più di un secolo si riferisca all’organismo che studiamo come Sciara coprophila, il suo attuale nome tassonomico è ora Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola e altri sinonimi)¹⁰. Si trovano in tutto il mondo e sono comunemente conosciuti come moscerini dei funghi poiché mangiano funghi e altri funghi. Furono descritti per la prima volta nel 1804 da Meigen¹³ in Europa e successivamente da Johannsen ^14,15 in Nord America. B. coprophila è stato raccolto al Cold Spring Harbor Laboratory e le scorte di laboratorio sono state create da Charles Metz nei primi anni del 1900, quando era uno studente laureato alla Columbia University con Thomas Hunt Morgan. Pertanto, gli stock attuali riflettono un secolo di consanguineità. Allo stesso modo, la biologia di B. coprophila è stata ulteriormente chiarita da decenni di studi citogenetici di Helen Crouse (che ha svolto il suo dottorato di ricerca con Barbara McClintock).

Negli anni ’30, la Bradysia (Sciara) entrò in competizione con la Drosophila melanogaster come sistema modello per gli studi genetici. Nonostante le sue numerose caratteristiche biologiche uniche, B. coprophila è stato eclissato da D. melanogaster come organismo modello popolare poiché le mutazioni fenotipiche indotte dalle radiazioni erano necessarie per gli studi genetici ed erano più facili da ottenere in quest’ultimo, anche se B. coprophila è solo leggermente più resistente all’irradiazione gamma rispetto a D. melanogaster¹⁶. Nell’era moderna della genomica, questo non è più un problema. Dal momento che la sequenza del genoma ^17,18,19 (Urban, Gerbi e Spradling, dati non mostrati) e i metodi per la trasformazione ^20,21 (Yamamoto e Gerbi, dati non mostrati) per B. coprophila sono diventati recentemente disponibili, i tempi sono ora maturi per utilizzarlo come un nuovo/vecchio sistema modello emergente, come visto dalla crescente comunità di scienziati che lo hanno adottato per le loro ricerche. Questo articolo descrive le procedure per la manutenzione del laboratorio.

B. coprophila manca di un cromosoma Y e il sesso della prole è determinato dalla madre. Le femmine che hanno il cromosoma X’ (“X-prime”) con una lunga inversione paracentrica avranno solo figlie femmine, mentre le femmine che sono omozigoti per il cromosoma X standard (non invertito) avranno solo figli maschi⁵ (Figura 2). Le informazioni sulla sequenza sono disponibili per il cromosoma X’¹⁹, ma il meccanismo molecolare rimane da chiarire su come il cromosoma X’ determini che la prole sarà femmina. I maschi non hanno mai il cromosoma X’ e, dopo la fecondazione, le femmine sono X’X (eterozigoti per X’) o XX. Le femmine adulte di X’X possono essere distinte dalle femmine XX per i marcatori fenotipici sull’ala (Figura 3). Le femmine X’X (che avranno solo figlie femmine) possono essere riconosciute dal marcatore dominante dell’ala ondulata (W) sulla X’ (come nel ceppo HoLo2)²². In alternativa, le femmine XX (che avranno solo figli maschi) possono essere riconosciute dall’indicatore recessivo dell’ala minuscola (p) sulla X come nel 91S stock²³. In questo caso, le femmine X’Xp avranno ali a tutta lunghezza (non piccole) e avranno solo figlie. Il 6980 di serie porta un marcatore recessivo sul cromosoma X per le vene gonfie (sw)²⁴, così come il marcatore dominante Wavy sulla X’, che consente due marcatori per la selezione per le croci. Il grado di espressione di Wavy può variare e sembra più debole in fiale sovraffollate dove il cibo è limitato o se la temperatura diventa troppo calda. Il fenotipo dell’ala ondulata è eccezionalmente forte se le larve vengono tenute in cella frigorifera (4°-8 °C) invece dei soliti 21 °C. Sebbene il marcatore recessivo dell’ala piccola non sia variabile e sia molto facile da identificare, i calci 91S vengono utilizzati meno frequentemente poiché sono meno sani del calcio HoLo2. Gli schemi di accoppiamento di B. coprophila sono presentati qui (Figura 2) e descritti in dettaglio per gli stock HoLo2, 7298 e W14 (Supplemental File 1), gli stock 91S (Supplemental File 1), gli stock 6980 (Supplemental File 1) e gli stock di traslocazione (Supplemental File 1). Gli stock di traslocazione non sono più esistenti; erano traslocazioni reciproche di eterocromomeri (H1, H2 e H3) sul braccio corto dell’X che contiene i geni dell’RNA ribosomiale 25,26,27.

Figura 2: Schema di accoppiamento per B. coprophila. Questo organismo non ha il cromosoma Y (il soma maschile ha una sola X); Le madri determinano il sesso della loro prole. Le madri XX hanno solo figli maschi e le femmine X’X hanno solo figlie femmine. Il cromosoma X’ ha una lunga inversione paracentrica rispetto al cromosoma X. La linea paterna o materna del cromosoma X (o X’) è indicata rispettivamente con il blu o il rosso, in questa figura. Gli spermatozoi sono aploidi per gli autosomi, ma hanno due copie del cromosoma X a causa della non disgiunzione nella meiosi II. La linea somatica degli embrioni precoci elimina una o due copie dell’X di derivazione paterna se saranno rispettivamente femmina o maschio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Fenotipi alari di B. coprophila. Le mosche femmine adulte sono mostrate con vari fenotipi di ali: (A) ala dritta (XX), (B) ala ondulata (_X’WX), (C) fenotipo di ala ondulata estrema (_X’WX) che ha un aspetto raggrinzito dopo aver immagazzinato le larve nel roo m freddo, (D) ala piccola (XpXp) che è vestigiale, (E) ala dritta con tipo selvatico (XX) e vene non gonfie, (F) ala diritta con vene gonfie (XswXsw) dove compaiono piccole bolle (frecce nere) sul bordo superiore dell’ala e/o vicino alla punta di entrambe le ali, (G) esempio estremo di rigonfiamento dove una vescica (freccia bianca) si verifica su una o entrambe le ali. I maschi mancano del cromosoma X’ e quindi non avranno mai ali ondulate, ma hanno ali piccole o gonfie rispettivamente nel ceppo 91S o 6980. Barra della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L’obiettivo nel mantenimento del bestiame è quello di eseguire incroci in cui metà degli incroci provengono da madri che producono femmine e metà gli incroci da madri che producono maschi per avere un numero uguale di adulti femmine e maschi nella generazione successiva per gli incroci successivi. Tuttavia, ciò comporta anche la pianificazione, poiché il ciclo di vita dei maschi è più breve rispetto a quello delle femmine e i maschi adulti emergono fino a una settimana prima delle femmine adulte. La natura accoglie questa asincronia tra i sessi facendo emergere gli embrioni maschili come larve 1-2 giorni dopo le larve femminili da un incrocio nella stessa data. Tuttavia, per garantire che maschi e femmine adulti siano disponibili contemporaneamente per le croci di laboratorio, lo sviluppo delle femmine può essere in qualche modo accelerato lasciando fiale con larve femmine a temperatura ambiente piuttosto che a 21 °C o posizionando fiale con larve maschili a temperature leggermente più fresche (ad esempio, 16 °C). Un altro percorso più infallibile è quello di fare incroci con madri produttrici il lunedì e incroci con madri produttrici il venerdì della stessa settimana. Il percorso più semplice, che è quello che utilizziamo, è quello di eseguire incroci con madri produttrici e produttrici lo stesso giorno ogni settimana ed eseguire incroci in quel giorno in ogni settimana consecutiva. In questo approccio, le femmine adulte di un incrocio alla settimana 1 possono essere accoppiate con maschi adulti emersi da un incrocio alla settimana 2.

Il ciclo di vita della femmina di B. coprophila è di 5 settimane se allevata a 21 °C (Tabella 1). La durata del loro ciclo di vita è un po’ più lunga a temperature più basse o se sono denutriti. Il ciclo di vita del maschio di B. coprophila è di ~4-4,5 settimane poiché si impupano 0,5-1 settimana prima delle femmine. La fine di ogni stadio larvale è contrassegnata dalla perdita della cuticola, che è innescata da un’esplosione del livello dell’ormone steroideo ecdisone. A differenza di D. melanogaster, che ha tre stadi larvali, B. coprophila ha quattro stadi larvali.

Fase di sviluppo	Giorni dopo l’accoppiamento (dpm)	Durata della tappa (giorni)
Deposto l’uovo	1-2
Embrione	Da 1-2 a 7-8	~7 giorni
Larva
Gli stadi larvali 1, 2 e 3	dal 7-8 al 16-19	~10
4° stadio larvale pre-macchia oculare	dalle 16-19 alle 21-24	5
4° stadio larvale della macchia oculare	dal 21-24 al 25-28	4
Pupa	da 25-28 a 30-33	5
Adulto	vive 1-2 giorni a 21 °C se accoppiato o vive 2-3 settimane a 16 °C se non accoppiato.

Tabella 1: Ciclo vitale della femmina di B. coprophila a 21 °C.

B. coprophila può essere allevato ovunque nell’intervallo 15 °C-25 °C, con uno sviluppo che progredisce più lentamente a temperature più fresche. Questo insetto predilige un ambiente umido (trovandosi nel terreno di piante d’appartamento o aiuole di funghi), quindi teniamo un bicchiere con acqua deionizzata nell’incubatrice. La B. coprophila può essere conservata a temperatura ambiente in una scatola per il pane di metallo con un coperchio largo e contenente un bicchiere d’acqua, ma va in shock termico a 37 °C²⁸, che è un pericolo nei climi caldi. Michael Ashburner e altri hanno cercato con scarso successo di conservare D . melanogaster al freddo per ridurre il tempo necessario per la conservazione delle scorte. Al contrario, uno dei principali vantaggi di B. coprophila è che le fiale con larve allo stadio intermedio possono essere conservate fino a 3 mesi su uno scaffale aperto nella cella frigorifera (4-8 °C) con una cura minima di somministrare solo una volta al mese. Si sviluppano molto lentamente al freddo fino allo stadio di pupa e riemergeranno come adulti fertili quando le fiale saranno riportate a 21 °C. Presumibilmente, questo imita il loro svernamento in natura. Questo stallo dello sviluppo indotto dal freddo potrebbe essere paragonabile a quello osservato dopo l’irradiazione gamma delle larve di B. coprophila allo stadio intermedio¹⁶, ma lo stallo dello sviluppo non si osserva nelle larve in stadio avanzato che hanno superato il punto di non ritorno per la loro normale progressione dello sviluppo.

Protocol

I protocolli qui descritti rappresentano un secolo di esperienza nei centri di stoccaggio di Bradysia (Sciara) supervisionati in sequenza da Charles Metz, Helen Crouse e Susan Gerbi, nonché dal contributo di altri. 1. Incroci di accoppiamento Utilizzare una femmina adulta e due maschi adulti per flaconcino di vetro di 28 mm di diametro. Una volta raggiunto il 100% di successo nel riconoscere i fenotipi delle ali per le madri che avranno solo figlie o figli, utilizzare due femmine e due maschi per fiala per aumentare il numero di larve/fiala. Aggiungi le femmine a ogni fiala prima di aggiungere i maschi che si svegliano più velocemente dall’anestesia rispetto alle femmine.NOTA: La descrizione seguente presume che tu abbia CO2; In alternativa, l’etere può essere utilizzato per anestetizzare le mosche adulte. Se si utilizza l’etere per anestetizzare le mosche adulte, fissare con del nastro adesivo un tampone di salviette da laboratorio piegate (ad esempio, salviette kim) all’interno di un coperchio di vetro rotondo di un barattolo di Coplin e utilizzare un contagocce per trasferire un po’ di etere dalla bottiglia per inumidire il tampone da laboratorio (ma non saturo e così umido che il liquido dell’etere cadrà da esso e rischierà di affogare le mosche). Per il passaggio 1.6 di seguito, posizionare il tampone di etere inumidito sopra la fiala aperta per ~1 minuto fino a quando gli adulti non smettono di muoversi. Una volta che gli adulti sono stati trasferiti su una piastra di piastrelle di ceramica bianca (usata al posto del fly-pad bianco), periodicamente (quando le zampe delle mosche iniziano a contrarsi) tenere il cuscinetto che è stato appena inumidito con l’etere sopra (senza toccare) le mosche sulla piastra per ~ 1 minuto.ATTENZIONE: L’etere è infiammabile e deve essere conservato in una cappa di ventilazione e non in frigorifero. Disporre a portata di mano un vassoio con fiale di femmine adulte, un vassoio con maschi adulti e un vassoio di fiale vuote contenenti il 2,2% (peso/volume) di agar. Sul banco del laboratorio, posiziona dei cartelli che indichino “femmina” o “maschio” e il fenotipo dell’ala della madre in modo che la fiala con gli adulti selezionati per la croce venga inserita nel gruppo corretto, dove tutte le fiale di un gruppo avranno solo progenie maschile e tutte le fiale dell’altro gruppo avranno solo progenie femminile.NOTA: Assicurarsi che non vi siano goccioline di condensa all’interno della fiala poiché gli adulti si attaccheranno alle goccioline. Se le fiale sono state conservate in una scatola di plastica, metterle su un banco da laboratorio a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell’uso per far evaporare la condensa. Accendere il gas CO2 e la lampada per il microscopio da dissezione.NOTA: È preferibile una fonte di luce con fibre ottiche in quanto emette meno calore, il che fa sì che i moscerini anestetizzati si sveglino più velocemente. Picchiettare energicamente la fiala con gli adulti su un cuscinetto di gomma in modo che gli adulti cadano sul fondo della fiala e rimuovere il tappo; inserire l’ugello della pistola CO2 e rimontare il tappo. Premere il grilletto dell’ugello in modo che la CO2 fluisca nella fiala per ~1 minuto per anestetizzare gli adulti. Mettere un piede sul pedale in modo che la CO2 fluisca sul fly-pad bianco piuttosto che sull’ugello della pistola. Tenere premuto il pedale per tutto il tempo in cui le mosche sono sul fly-pad bianco (oppure premere a intermittenza il pedale ogni volta che le zampe delle mosche iniziano a contrarsi). Rimuovere l’ugello e il tappo dalla fiala e capovolgere la fiala su un cuscinetto bianco al microscopio da dissezione. Picchiettare il fondo della fiala capovolta contro il microscopio in modo che gli adulti cadano dalla fiala sul cuscinetto bianco. Seleziona gli adulti più grassi (recentemente chiusi con addomi bianchi) e usa una pinza a punta fine per sollevare delicatamente l’adulto per la zampa centrale o posteriore. Non ferire le zampe anteriori che vengono utilizzate per la danza dell’accoppiamento. Non utilizzare adulti che si sono appena chiusi e i cui corpi sono completamente bianchi e non ancora diventati neri perché le loro ali saranno corte e non completamente sviluppate in modo che il fenotipo delle ali non possa essere valutato. Gli adulti con addomi più sottili possono ancora essere utilizzati, anche se hanno una fertilità ridotta. Non usare adulti magri le cui ali sono sollevate verticalmente lontano dal corpo, poiché sono morti. Con l’altra mano, rimuovere il tappo dalla fiala con agar al 2,2% (wt/vol). Con la mano che tiene la pinza con l’adulto, picchiettare energicamente la pinza contro la parete interna superiore del flaconcino in modo che l’adulto cada sul fondo del flaconcino. Riposizionare il tappo nella fiala. Ripetere i passaggi 1.5-1.11 sopra per impostare ogni fiala contenente le femmine adulte. Usa un pennello per spazzare via le mosche inutilizzate dal fly-pad bianco nella loro fiala madre. Metti un segno di spunta sull’etichetta della fiala genitore per indicare che è stata utilizzata per l’accoppiamento (anche se può essere riutilizzata se necessario). Per la manutenzione ordinaria delle scorte, allestire 6-8 fiale con le madri produttrici e 6-8 fiale con le madri produttrici (Figura 4). Prepara metà delle fiale con le madri (o i padri) da una fiala per adulti e l’altra metà delle nuove fiale utilizzando una fiala per adulti diversa per ridurre al minimo i colli di bottiglia genetici.Occasionalmente, un evento di errata segregazione produrrà un maschio eccezionale in fiale che producono femmine. Se una fiala con femmine adulte ha un maschio eccezionale, rimuovila e schiacciala per uccidere quel maschio. Se possibile, scartare tutte le femmine da quella fiala e attendere qualche giorno fino a quando altre femmine adulte si chiudono e possono essere tranquillamente utilizzate per le croci.NOTA: È preferibile non utilizzare le femmine in quella fiala per gli incroci perché potrebbero essersi accoppiate con il maschio eccezionale e non produrre un incrocio fertile. Una volta che le femmine adulte sono state aggiunte a tutte le fiale, ripetere i passaggi 1.5-1.11 per aggiungere due maschi adulti (Figura 4) a ciascuna fiala che contiene già mosche femmine. Picchiettare la fiala con le femmine su un tampone di gomma in modo che non scappino quando i due maschi vengono aggiunti in sequenza.NOTA: Lavora rapidamente e non anestetizzare eccessivamente le mosche adulte in quanto ciò le ucciderà. Aggiungi un’etichetta a ogni fiala che indichi il brodo, la croce (per la progenie femminile o maschile), se la madre proveniva dalla fiala adulta #1 o #2 e la data di accoppiamento. Inserire anche le informazioni di cui sopra in un quaderno e indicare il numero di fiale impostate per ogni croce.NOTA: È conveniente aggiungere un tovagliolo di carta per separare le fiale di produzione maschile da quelle di produzione femminile nel vassoio. Lascia le fiale indisturbate sul piano di lavoro per ~15 minuti per essere sicuro che gli adulti si sveglino e volino in giro. Osserva se si stanno accoppiando (molto presto dopo il risveglio) dove la femmina e il maschio sono orientati posteriormente a posteriormente (il maschio afferrerà l’ovopositore appuntito della femmina) (Figura 4, in basso).NOTA: Una femmina adulta accetterà un maschio adulto solo una volta, quindi non spingere le fiale dopo l’accoppiamento in quanto ciò potrebbe separare il maschio dalla femmina durante il processo di accoppiamento e quella femmina non si riaccoppierà. Posizionare il vassoio con i flaconcini accoppiati nell’incubatore (ad es. 21 °C). Etichettare il vassoio con il nome del brodo (ad esempio, HoLo2) e la settimana del ciclo di 5 settimane (settimane 1, 2, 3, 4 o 5).NOTA: Conservare il vassoio con le mosche appena accoppiate in una parte separata dell’incubatrice o di un’altra incubatrice come promemoria per non alimentare le fiale fino a quando le larve non sono emerse (descritte di seguito). 2. Accoppiamento di massa NOTA: In genere, una singola madre di B. coprophila avrà 60 figli nella sua nidiata. Quando è richiesto un numero maggiore di prole per gli esperimenti, è possibile effettuare un accoppiamento di massa invece dell’accoppiamento a coppia singola descritto sopra. L’accoppiamento di massa può essere effettuato nelle fiale di vetro standard di 28 cm di diametro quando le madri verranno raccolte il giorno dopo per la deposizione indotta degli ovuli e il prelievo degli embrioni. Tuttavia, se è necessario un numero maggiore di larve, l’accoppiamento di massa viene effettuato in un barattolo con una superficie più ampia per evitare il sovraffollamento. Fai diversi piccoli fori nel coperchio del barattolo in modo che le larve possano respirare un po’ d’aria. Segui i passaggi precedenti nella sezione 1, ma usa una pinza a punta fine per spostare tutte le madri produttrici (o tutte le madri produttrici maschi) in un angolo anteriore del cuscinetto bianco. Utilizzare 10-15 femmine adulte grasse anestetizzate e spazzare questo gruppo con un pennello nella fiala o nel barattolo con piccoli fori praticati nel coperchio.NOTA: Eseguire i passaggi 2.1 e 2.2. rapidamente per l’accoppiamento di massa per evitare un’eccessiva anestesia che impedirebbe incroci fertili. Seleziona 20-25 maschi adulti grassi anestetizzati e spostali con una pinza a punta fine nell’angolo anteriore del fly-pad bianco. Picchiettare energicamente la fiala o il barattolo con le femmine su un tampone di gomma in modo che non fuoriescano quando il tappo o il coperchio vengono rimossi per spazzare il gruppo anestetizzato di maschi adulti dal cuscinetto bianco usando un pennello. 3. Raccolta di embrioni dopo l’accoppiamento di massa Un giorno (24 ore) dopo l’accoppiamento, eseguire i passaggi 1.5-1.11 per anestetizzare le mosche adulte (miscela di femmine e maschi) e trasferirle su un fly-pad bianco.NOTA: L’ovogenesi non è ancora completata quando le mosche adulte si accoppiano, il che innesca la meiosi finale; Gli ovuli maturi vengono fecondati dagli spermatozoi immagazzinati nella spermateca quando gli ovuli vengono scaricati 29. Il completamento dell’ovogenesi può richiedere 1-2 giorni, motivo per cui è consentito 1 giorno dopo l’accoppiamento prima che venga indotta la deposizione delle uova. Con una pinza a punta fine, prendere una femmina adulta per le ali e posizionarla su una capsula di Petri di 100 mm di diametro contenente il 2,2% (peso/volume) di agar, con le ali inserite nell’agar. Ripeti questo passaggio in sequenza per ogni femmina adulta sul fly-pad bianco. Scartare i maschi adulti sulla piattaforma volante. Una volta che tutte le mosche femmine sono state impalate sull’agar, indurre la deposizione delle uova stringendo delicatamente la testa con una pinza fino a quando la mosca femmina non ha movimenti simili a convulsioni. In alternativa, stringile delicatamente il torace. Deporrà quindi un grappolo di uova fecondate entro 30-60 minuti. Coprire la capsula di Petri con il coperchio inumidito con una salvietta da laboratorio inumidita con acqua per evitare l’attrazione elettrostatica delle uova verso il coperchio. 4. Controllo della “schiusa” delle larve Verificare la “schiusa” delle larve 1 settimana dopo l’accoppiamento; Rimuovere il tappo dalla fiala e utilizzare un microscopio da dissezione per individuare le larve. La loro mascella nera si aprirà e si chiuderà ripetutamente e si muoveranno lentamente in avanti. Se ci sono solo poche larve, scrivi “poche” sull’etichetta della fiala, come promemoria per nutrire meno quella fiala. Esamina ogni fiala nel vassoio con quella croce e inserisci il numero di fiale con larve nel quaderno in una colonna accanto al numero di fiale che sono state posizionate in quell’accoppiamento.NOTA: Le uova giallo intenso non si svilupperanno. È probabile che si sviluppino uova bianche e 1 giorno prima che emergano le larve, il pigmento nero (la futura mascella) si svilupperà all’estremità anteriore dell’uovo. Non confondere la muffa con un filamento bianco che termina con una sfera nera alla sua estremità per larve: la muffa non si muoverà, a differenza delle larve che strisciano in avanti sull’agar. Aggiungi un po’ di cannuccia (solo una volta) a ogni fiala con le larve per controllare l’umidità in eccesso e fornire un nascondiglio per le larve. Spostare il vassoio nell’incubatrice (ad esempio, 21 °C) con i vassoi delle larve delle croci di accoppiamento delle settimane precedenti e iniziare a nutrire le fiale con le larve appena emerse (vedere la sezione seguente sull’alimentazione).NOTA: Generalmente, le larve saranno in un grappolo vicino alla madre morta e inizieranno a mangiarla; presumibilmente questo trasferisce il lievito dall’intestino della madre all’intestino delle larve. Puoi iniziare a nutrirti il giorno in cui emergono le larve o entro 2 giorni successivi. ATTENZIONE: Se l’alimentazione viene ritardata, le larve si mangeranno a vicenda, con una sola larva grassa rimasta per fiala! Continuare a controllare le fiale che non avevano ancora larve per 3 giorni alla settimana. Se non sono emerse larve dopo 7-10 giorni, scartare la fiala o conservarla per il lavaggio della fiala. 5. Preparare il cibo NOTA: Tutti gli ingredienti alimentari devono essere privi di pesticidi! Usa un cucchiaio per misurare i seguenti ingredienti in volume e depositali in una teglia di metallo o di vetro (ad esempio, una teglia in metallo da 8 pollici x 8 pollici): 4 parti di paglia d’avena (8 cucchiai), 2 parti di polvere di funghi Shitake (4 cucchiai), 1 parte di spinaci in polvere (2 cucchiai), 1 parte di ortica in polvere (2 cucchiai). Usa il cucchiaio per mescolare bene gli ingredienti nella padella.NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare 2 parti di sola polvere di spinaci o solo polvere di ortica invece di 1 parte di ciascuna. Coprire la teglia con un foglio di alluminio e sterilizzare in autoclave a ciclo secco per 20-30 min. Lascialo raffreddare a temperatura ambiente per una notte o più a lungo. Togliete la pellicola dalla padella e rompete la miscela di cibo sterilizzato incrostato, usando un movimento di macinazione con il cucchiaio per creare un composto polveroso. Aggiungere 1 parte (2 cucchiai colmi) di lievito di birra e mescolare bene nella miscela di alimenti autoclavati.NOTA: Il lievito di birra non è autoclavato in quanto ciò ucciderebbe il lievito. Trasferire la miscela alimentare in un barattolo sterile con tappo.NOTA: È possibile utilizzare lo stesso tipo di barattolo da 240 ml utilizzato per l’accoppiamento di massa e la ricetta sopra riempirà il barattolo. Allo stesso modo, lo stesso tipo di barattolo sterilizzato con tappo deve essere riempito solo con paglia che è stata sterilizzata in autoclave in una padella ricoperta di carta stagnola. 6. Alimentazione NOTA: Regolare la quantità di cibo somministrata in base all’età e alla quantità di larve. Dai molto cibo ai barattoli con molte larve da un accoppiamento di massa. Dare solo una leggera spolverata di cibo alle piastre di Petri con larve che vengono conservate per alcuni giorni per la stadiazione dello sviluppo. Il metodo di alimentazione descritto di seguito è stato sviluppato nel laboratorio di Charles Metz 29 ed è stato utilizzato dal suo laboratorio e da Helen Crouse, Susan Gerbi e altri con successo per un secolo. Lavarsi le mani e risciacquare bene per rimuovere il sapone.NOTA: I guanti non sono raccomandati in quanto diminuiscono la sensazione delle dita per regolare la quantità di cibo somministrata a ciascuna fiala. Conservare un barattolo sterile tappato con paglia macinata e un barattolo sterile con il cibo nell’incubatrice (ad es. 21 °C) dove sono conservate le larve. Togliete il coperchio dal barattolo e versate un po’ di cibo in una ciotola pulita (ad es. un piatto di caramelle) per un accesso più facile; Riposizionare il coperchio del barattolo contenente il cibo rimasto. Conservare la ciotola aperta con il cibo in un vaschetta di metallo o vetro; Ciò impedirà agli acari o ad altri insetti di strisciare sulla parete del vassoio per entrare nella ciotola con il cibo. Raccogli un po’ di cibo tra il secondo e il terzo dito (o tra il pollice e il secondo). Con l’altra mano, rimuovere una fiala dalla vaschetta e rimuovere il tappo, tenendolo con le dita durante l’alimentazione. Esaminare la fiala per l’età e il numero di larve e depositare la quantità appropriata di cibo nella fiala ruotando le due dita che tengono il cibo l’una contro l’altra. Le fiale con larve appena emerse hanno bisogno solo di pochi chicchi di cibo. Le fiale con larve più vecchie dovrebbero avere un sottile strato di cibo che copre la parte superiore dell’agar. Se c’è della muffa bianca nella fiala, utilizzare etanolo al 70% spruzzato su una salvietta da laboratorio per pulire una lunga sonda metallica (ad esempio, con un manico di legno), rimuovere il tappo e inserire la sonda pulita nella fiala per picchiettare lo stampo sulla superficie dell’agar. Se c’è molta muffa, agitare la sonda per avvolgere lo stampo attorno alla sonda per rimuoverla dalla fiala. Non disturbare la parte superiore dell’agar poiché le larve vivono lì; Aggiungere solo una piccola quantità di cibo e rimettere il tappo nella fiala. Pulire la sonda con un panno da laboratorio inumidito con etanolo al 70% prima di riporre la sonda o utilizzarla per pulire un’altra fiala. Una volta che tutte le fiale in un vassoio sono state alimentate, riposizionare il vassoio nell’incubatore e rimuovere il vassoio successivo per l’alimentazione come al punto 6.3. Al termine dell’alimentazione, versare il cibo rimanente dalla ciotola nel barattolo precedentemente sterilizzato, tappare il barattolo e conservarlo nell’incubatrice. 7. Raccolta di larve o pupe su piastre di Petri Per un piccolo numero di larve, utilizzare una sonda metallica o una spatola che è stata pulita con etanolo al 70% per scavare nello strato superiore di agar in una fiala per trasferire l’agar aderente con alcune larve in una capsula di Petri sterile di 100 mm di diametro riempita a metà con agar al 2,2% (wt/vol). Per un numero maggiore di larve, inserire una spatola lungo la parete nella parte inferiore della fiala per facilitare l’estrazione del tappo di agar dalla fiala e depositarla a faccia in su in una capsula di Petri vuota. Utilizzare un microscopio da dissezione per trovare le larve nella parte superiore del tappo di agar e trasferirle con una pinza a punta fine in una piastra di Petri sterile di 100 mm di diametro riempita a metà con agar al 2,2% (peso/volume). Usa un microscopio da dissezione per ordinare le larve con pinze a punta fine in gruppi dello stesso stadio di sviluppo.NOTA: A causa della leggera asincronia dello sviluppo, ci saranno diversi gruppi di larve selezionate sulla piastra di Petri con agar al 2,2% (wt/vol). Aggiungere una piccola spolverata di cibo e posizionare la capsula di Petri con le larve nell’incubatrice. Rimuoverlo quotidianamente per l’osservazione con il microscopio da dissezione per la selezione dello stadio di sviluppo desiderato.NOTA: Per gli studi sul soffio del DNA, le larve precoci delle macchie oculari procedono attraverso gli stadi 10×5, 12×6, 14×7 e edge eye/drop-jaw con ~1 giorno in ciascuno di questi stadi 30,31. Scegli pupe i cui occhi sono da 1/4 a 1/2 pieni di pigmento per avere gli stadi di meiosi I e II nei testicoli pupali. 8. Conservazione in cella frigorifera delle larve Come riserva, conservare nella cella frigorifera circa quattro fiale di larve femminili e quattro fiale di larve maschili da 2 settimane consecutive di incroci. Per la conservazione di riserva, nutrire le larve che sono all’inizio del 4° stadio ( stadio pre-macchia oculare) e metterle in un vassoio aperto su uno scaffale nella cella frigorifera; Somministrare queste fiale solo una volta al mese. Togliete le 16 fiale delle 2 settimane consecutive di incroci di accoppiamento dal freddo dopo 2-3 mesi (segnatelo su un calendario come promemoria); metterli in un’incubatrice (ad esempio, 21 °C) per nutrirli normalmente e lasciarli sviluppare in adulti da utilizzare per le croci. Quando le fiale vengono rimosse dalla cella frigorifera, mettere un nuovo set di fiale con larve di 4° stadio precoce nella cella frigorifera in modo che queste fiale siano sempre disponibili come riserva per le scorte.NOTA: La vitalità dopo la conservazione in cella frigorifera non è stata testata sistematicamente per le diverse fasi di sviluppo, ma la nostra esperienza rivela che la conservazione a freddo delle larve precoci del 4° stadio funziona bene. 9. Lavaggio delle fiale Dopo che gli adulti sono morti (~2-3 settimane dopo l’eclosione), rimuovere le fiale dall’incubatrice e posizionarle a 60-70 °C per 1 ora per uccidere eventuali organismi rimasti. Togliete i tappi di cotone e conservateli in una scatola di plastica. Utilizzare una spatola per raschiare il tappo di agar dalla fiala in un bidone dei rifiuti. Immergere le fiale per una notte o più a lungo immerse in acqua in una lavastoviglie. Utilizzare una spazzola per provette conservata solo per questo scopo (mai utilizzata per recipienti con sostanze chimiche né con sapone) e strofinare su e giù nella fiala sotto l’acqua corrente del rubinetto. Posizionare la fiala pulita con il lato aperto rivolto verso il basso in un cestello di metallo. Riempi il cestello con le fiale pulite.NOTA: Non usare mai sapone nelle fiale poiché qualsiasi residuo di sapone potrebbe uccidere B. coprophila. Aggiungere un coperchio in rete metallica al cestello e, tenendo il coperchio in posizione, capovolgere il cestello per riempire tutte le fiale con acqua deionizzata. Tenendo ancora il coperchio in posizione, capovolgere il cestello per svuotare l’acqua deionizzata dalle fiale. Ripetere i risciacqui con acqua deionizzata 4 volte. Posizionare i cestelli con le fiale pulite su tovaglioli di carta o su una piattaforma a rete aperta (ad es. carrello da laboratorio) per asciugarli durante la notte o più a lungo. Conservare le fiale asciutte in un cassetto.NOTA: Non lasciare che le fiale con adulti morti rimangano troppo a lungo prima di lavarle in quanto potrebbe invitare un’infestazione di acari. 10. Versare l’agar Riempi un contenitore capiente (cestello di metallo o vassoio di metallo) con fiale pulite e aggiungi un tappo di cotone a ciascuna fiala. Riutilizzare i tappi prelevati da vecchie fiale quando le fiale sono state lavate e utilizzare ripetutamente i tappi fino a quando non si degradano e si sfaldano e devono essere gettati. Sterilizzare il contenitore con le fiale tappate a secco per ~30 minuti e lasciarle raffreddare a temperatura ambiente per conservarle nel contenitore dell’autoclave. Tenere sempre a portata di mano due contenitori (uno in uso attivo e uno di scorta) con i flaconcini tappati in autoclave. Mettere 11,0 g di polvere di agar in un pallone di Erlenmeyer da 1 L e aggiungere 500 ml di acqua distillata per ottenere una soluzione di agar al 2,2% (wt/vol) sufficiente a versare ~24 fiale (~21 mL/flaconcino). Agitare il pallone e metterlo in un forno a microonde.NOTA: Da qui in poi, utilizzare un guanto per autoclave resistente al calore per maneggiare il pallone. La stessa soluzione di agar al 2,2% (peso/volume) può essere versata in piastre di Petri (per larve raccolte) o barattoli (per accoppiamenti di massa) se necessario. Microonde per 1 minuto, rimuovere il pallone per farlo roteare, rimetterlo nel forno a microonde e cuocerlo nuovamente nel microonde per 1 minuto. Ripeti l’operazione più volte. Guarda la fiaschetta attraverso la porta di vetro del forno a microonde. Quando la soluzione di agar agar inizia a schiumare e a bollire, utilizzare immediatamente il pulsante di arresto manuale. Non agitare il pallone a questo punto (potrebbe traboccare), e rimuovilo con cura dal forno al bancone e lascialo riposare per qualche minuto. Rimuovere il tappo da una fiala sterilizzata e tenerlo con una mano; Utilizzare l’altra mano per versare ~2,5 cm di agar al 2,2% nella fiala sterilizzata. Quindi, riposizionare il tappo nella fiala. Ripetere l’operazione fino a quando tutto l’agar è stato versato.NOTA: Se viene versato troppo poco agar nel flaconcino, si asciugherà più rapidamente durante l’uso e si restringerà lontano dalle pareti del flaconcino. Se viene versato troppo agar nella fiala, è difficile concentrarsi sullo strato superiore quando si segna la “baby-hatch” delle larve con un microscopio da dissezione. Lasciare le fiale versate sul bancone a temperatura ambiente per 1-2 giorni in modo che l’agar si indurisca e l’umidità evapori completamente. Usa le fiale per l’accoppiamento delle croci o conservale sdraiate su un fianco in una scatola di plastica con un coperchio ermetico; Posizionare un tovagliolo di carta inumidito con acqua sopra i flaconcini prima di mettere il coperchio sulla scatola (questo eviterà che l’agar si secchi e si restringa lontano dalla parete del flaconcino). Conservare la scatola con le fiale versate a temperatura ambiente per alcuni giorni o in frigorifero a 4 °C o in cella frigorifera per un massimo di 2 settimane. Prima di utilizzare le fiale conservate, rimuoverle dalla scatola e lasciarle sul bancone a temperatura ambiente per un’ora o due per far evaporare la condensa dall’interno delle fiale (le mosche adulte si attaccherebbero alla condensa e annegherebbero). 11. Realizzazione di tappi per fiale Mettere una fiala pulita in un supporto per provette di polistirolo da 50 ml (forzare la provetta in modo che sia dritta). Tagliate un quadrato di garza (2-4 strati di spessore) e posizionatelo sopra la fiala. Metti i ritagli di garza dei tappi precedentemente realizzati sopra la garza per creare uno strato più spesso. Metti il cotone sopra la garza e premi nella fiala, assicurandoti di riempire bene il pollice superiore della fiala. Tenere insieme la parte superiore delle estremità della garza e legarla con lo spago. Taglia lo spago in eccesso e la garza in eccesso (lascia abbastanza code dello spago per tenerlo legato e abbastanza garza per afferrare comodamente il tappo).NOTA: Montare le spine in modo che siano aderenti. Dovresti essere in grado di estrarli con l’indice e l’indice mentre li tieni in una mano. Se si prende la fiala per il tappo e cade, è troppo allentata. Se emette un forte scoppiettio quando viene estratto, potrebbe essere troppo stretto. Se troppo stretto o se il tappo ha uno strato di agar duro e secco su di esso, le mosche possono soffocare. Se il tappo è un po’ troppo allentato o scivola lungo i lati della fiala, può essere picchiettato sul piano di lavoro per schiacciarlo in una dimensione leggermente più larga. 12. Programma settimanale tipico (per la massima efficienza, eseguire le attività nell’ordine elencato) Lunedì (~30 min)Nutrire le fiale con le larve. Versare l’agar in fiale sterili e pulite con tappi. Mercoledì (~2 h)Mettere le fiale con gli adulti morti in forno per 1 ora e conservarle per il lavaggio. Controlla la presenza di larve “baby-hatch”. Nutrire le fiale con le larve. Esegui incroci di accoppiamento settimanali. Altri compiti secondo necessità: pulire in autoclave le fiale con tappi per avere una riserva di riserva secondo necessità; preparare nuovo cibo e sterilizzare in autoclave la paglia secondo necessità; barattoli per autoclave secondo necessità per cibo e paglia. Venerdì (~30 min)Controlla la presenza di larve “baby-hatch”. Nutrire le fiale con le larve.

Representative Results

I protocolli qui descritti hanno portato a un comprovato successo nell’allevamento di B. coprophila. Quando gli adulti grassi recentemente chiusi vengono scelti per l’accoppiamento (Figura 4), oltre il 90% degli incroci può essere fertile e produrre prole. Il successo della fertilità varia a seconda dei ceppi (Tabella 2). Lo stock 7298 (cromosoma X’ con marcatore ondulato) era il più sano degli stock, ma ha attraversato un periodo di declino, apparentemente a causa dell’attivazione di elementi mobili del DNA che creano riarrangiamenti del genoma32. Il ceppo HoLo2 rappresenta un ceppo sano derivato dal 7298, dove apparentemente i riarrangiamenti del genoma si sono stabilizzati, e ha sostituito il ceppo parentale 7298 nel centro di allevamento. Il ceppo HoLo2 è quello che è stato utilizzato per sequenziare il genoma di B. coprophila ed è quello più utilizzato da vari gruppi di laboratorio. Recentemente, la mutagenesi CRISPR delle mosche HoLo2 è stata utilizzata per creare il ceppo W14 con un fenotipo di occhio bianco da utilizzare per la trasformazione con marcatori oculari fluorescenti (Yamamoto e Gerbi, dati non mostrati). La varietà W14 è eccezionalmente robusta. Il calcio 6980 (ala ondulata e marcatori di vene gonfie) è un po’ meno robusto e il calcio 91S (marcatore ad ala piccola) è ancora meno robusto. Gli incroci riusciti danno origine a embrioni (Figura 5). Gli embrioni subiscono l’eliminazione dei cromosomi X paterni impressi dalla 7aalla 9a divisione di scissione. Inoltre, i cromosomi L limitati alla linea germinale vengono eliminati dalla linea somatica negli embrioni dalla 5aalla 6a divisionedi scissione . Gli embrioni emergono come larve, che non devono essere confuse con la muffa che può essere presente (Figura 6). Le macchie oculari (dall’anca agli occhi adulti) compaiono nella seconda metà del 4°stadio larvale (Figura 7). La dimensione delle macchie oculari fornisce un comodo marcatore fenotipico per l’insorgenza e la progressione dell’amplificazione del DNA puff, che è uno degli unici due esempi noti di amplificazione del DNA intracromosomico sito-specifico regolata dallo sviluppo naturale (gene). Successivamente, le pupe si sviluppano e la quantità di pigmento che riempie i loro occhi può fungere da marcatore di sviluppo per la meiosi I e II nella spermatogenesi (Figura 8) con i suoi comportamenti cromosomici unici in queste divisioni. Figura 4: Accoppiamento di mosche adulte di B. coprophila . Il pannello superiore mostra i tre tipi di mosche adulte presenti nel ceppo HoLo2: madri che producono femmine con ali ondulate (X’WX femmine adulte), madri che producono maschi con ali dritte (XX femmine adulte) e maschi con ali dritte (X0 maschi adulti). Si noti l’ovopositore appuntito all’estremità posteriore delle mosche femmine e il clasper a forma di uncino all’estremità posteriore delle mosche maschili. Il pannello inferiore mostra un accoppiamento tra maschio e femmina, in cui il maschio ha afferrato l’ovopositore della femmina. Lo sperma verrà immagazzinato nella spermateca della femmina e feconderà gli ovuli man mano che vengono scaricati all’esterno. La lunghezza degli adulti è di 2,0 mm (maschi), 2,5 mm (femmine). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Embrioni di B. coprophila. Il pannello in alto a sinistra è una vista degli embrioni utilizzando la luce standard in un microscopio da dissezione; I nuclei nel citoplasma sinciziale appaiono come punti neri. Il pannello a destra utilizza la microscopia a fluorescenza per visualizzare i nuclei colorati con ioduro di propidio degli embrioni. Gli embrioni hanno una lunghezza media di 200 micron e una larghezza media di 150 micron. I nuclei delle cellule germinali si raggruppano al polo posteriore dell’embrione, come si vede per i cicli 6 (embrione inclinato in avanti) e 7-9, dopo di che sono intervallati da nuclei somatici. L’eliminazione del cromosoma L nella linea somatica avviene nella divisione di scissione 5 o 6; L’eliminazione del cromosoma X nella linea somatica avviene nella7a, 8a o 9a divisionedi scissione. La cellularizzazione avviene durante l’interfase del ciclo 11. La tabella a sinistra mostra la durata media di ogni ciclo di divisione a 22 °C. Il tavolo a sinistra e il pannello a destra sono stati adattati con il permesso di de Saint Phalle e Sullivan35. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Gli embrioni di B. coprophila emergono come larve. Un grappolo di embrioni (freccia spessa blu) è visibile vicino all’ovopositore della femmina adulta morta dopo la deposizione delle uova. Una settimana dopo la deposizione delle uova, gli embrioni diventano giovani larve, molte delle quali sono indicate dalle frecce nere. Le larve appena emerse hanno una mascella nera all’estremità anteriore e un corpo traslucido. Si muovono sopra la superficie dell’agar e non devono essere confusi con la muffa che non si muove. L’inserto mostra una muffa, con un filamento bianco (freccia rossa) e una spora nera sulla punta (freccia verde), ed è leggermente più piccolo delle larve appena emerse. Barra della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Stadi della macchia oculare delle larve di B. coprophila . Le macchie oculari si formano nella parte anteriore della larva, appena dietro la mascella, e sono composte da granuli di pigmento che aumentano di numero. Le macchie oculari sono l’anlage dell’occhio adulto. Il pannello superiore mostra le larve che sono state visualizzate con un microscopio da dissezione; Il pannello inferiore è una vista ingrandita delle macchie oculari utilizzando un microscopio a contrasto di fase per visualizzare una larva su un vetrino da microscopio con una goccia di acqua distillata e un vetrino coprioggetti che galleggia leggermente sulla parte superiore. La nomenclatura degli stadi della macchia oculare è secondo Gabrusewycz-Garcia30 dove il numero di granuli è contato nella fila più lunga (ad esempio, 12) e viene annotato il numero di righe aggiuntive escludendo la riga più lunga (ad esempio, 6 per lo stadio della macchia oculare 12×6). L’inizio dell’amplificazione del DNA sito-specifico nei cromosomi politenici delle ghiandole salivari inizia allo stadio 10×5 della macchia oculare e si completa a 14×7 quando c’è un’esplosione di trascrizione al locus e l’espansione dei sbuffi di DNA31. Nella successiva fase di edge-eye/mascella abbassata, i granuli della macchia oculare iniziano a fondersi e si allontanano lateralmente dalla linea mediana; La lunghezza del corpo larvale si accorcia. Inoltre, i soffi di DNA si condensano in questa fase. Ci vuole circa un giorno a 21 °C per attraversare ogni stadio della macchia oculare. Barra della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Sviluppo delle pupe di B. coprophila . Durante l’impupamento, tutti i tessuti larvali si istolizzano ad eccezione del sistema nervoso e vengono sostituiti da tessuti adulti che originano dalle divisioni cellulari dei dischi immaginali. Il colore della carrozzeria cambia dal bianco all’abbronzatura, dal marrone al nero. Il pigmento si riempie gradualmente nell’occhio della pupa; la meiosi I e II si verifica nelle pupe maschili con occhi che sono da 1/4 a 1/2 riempiti di pigmento36. Barra della scala = 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nome di magazzino Marcatori Tasso di fertilità Commenti 7298 Ala ondulata (W) ~75% HoLo2 Ala ondulata (W) ~90% derivato da 7298 W14 Ala ondulata (W); Occhi bianchi ~95% derivato da HoLo2 6980 Ala ondulata (W); vene gonfie (SW) ~65% 91S ala ondulata debole (W); Ali piccole (P) ~50% il marcatore Wavy è stato introdotto in una croce per salvare la 91S Tabella 2: Stock di bradisia (Sciara) coprophila. La Tabella 1 di Gerbi6 elenca questi marcatori e altri che non sono più esistenti. Cinque traslocazioni (T1, T23, T29, T32, T70) all’estremità del centromero dell’X27 sono riassunte nella Figura 8 di Gerbi6 ma non sono più esistenti. File supplementare 1: Incroci HoLo2 (e 7298 e W14), incroci 91S e salvataggio, incroci 6980, incroci di traslocazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

I protocolli qui presentati per l’allevamento di B. coprophila saranno utili per gli scienziati che desiderano allevare questo organismo nei loro laboratori per esperimenti che approfondiscano le sue caratteristiche biologiche uniche. La descrizione iniziale del metodo di alimentazione con lievito e polvere di funghi spruzzata su una base di agar per mantenere B. coprophila²⁹ è stata utilizzata nel laboratorio di Metz per allevare 14 diverse specie^{di mosche} sciaridi. Successivamente, è stato osservato che l’aggiunta di ortica e/o polvere di spinaci aumentava ulteriormente la vitalità di B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia, comunicazione personale). Questi metodi hanno avuto successo per il mantenimento di specie imparentate all’interno della famiglia degli Sciaridae, tra cui Bradysia impatiens e Lycoriella ingenua che sono attualmente in coltura (Robert Baird, comunicazione personale).

Altri metodi (come i metodi di alimentazione alternativi descritti di seguito) sono stati provati per allevare B. coprophila, ma i protocolli qui descritti sono stati ottimizzati per avere il rapporto più favorevole di larve per superficie di agar per ottenere gli adulti grassi più fertili e ridurre al minimo la crescita di muffe. Per aumentare, l’accoppiamento di massa può essere effettuato in fiale di vetro come descritto nel protocollo 2 di cui sopra. In alternativa, alcune (2-4) femmine adulte possono essere messe insieme al doppio dei maschi adulti in una fiaschetta come quella usata per allevare la Drosophila (usa e getta 6 once = 177,4 ml di bottiglia di polipropilene Drosophila a fondo quadrato). In entrambi i casi, il ricercatore deve essere pienamente sicuro che il pallone contenga solo tutte le madri produttrici o tutte le madri produttrici maschili.

Nutri solo le larve poiché le pupe e gli adulti non mangiano. Non somministrare la fiala se le larve si sono trasformate in pupe (un segno di ciò è quando compaiono le prime mosche adulte ad emergere precocemente). Una volta che gli adulti si sono chiusi, mettere le fiale in un’incubatrice più fredda (ad es. 16 °C), se disponibile, in quanto ciò consentirà agli adulti di vivere più a lungo. Somministrare tre volte alla settimana (ad esempio, lunedì, mercoledì, venerdì), aumentando la quantità di cibo somministrata per fiala man mano che le larve invecchiano. Nutri generosamente e sarai ricompensato con adulti fertili e grassi. Tuttavia, se dai troppa poppa alla grande, apparirà della muffa bianca e questo è un segno per ridurre la quantità di cibo che stai depositando in una fiala. Inoltre, se si alimenta troppo, si svilupperà un denso cuscinetto di cibo sopra l’agar e renderà più difficile l’emergere degli adulti (è possibile rimuovere il cuscinetto con una pinza, ma fare attenzione a non estrarre le larve con il tampone: è meglio non doverlo fare affatto). Le fiale con poche larve (contrassegnate con “poche”) hanno bisogno di meno cibo. Se ti nutri troppo poco, le larve si arrampicheranno sulle pareti della fiala in cerca di cibo. Le larve denutrite danno luogo a piccoli adulti meno fertili.

Metodi di alimentazione alternativi
È stata tentata una varietà di metodi per nutrire le larve solo una volta durante lo stadio larvale piuttosto che 3 volte a settimana. B. coprophila non crescerà su cibo in stile Drosophila . John Urban (comunicazione personale) ha provato a mescolare il cibo di B. coprophila con l’agar, ma è cresciuta troppa muffa. Ha scoperto che l’aggiunta di due inibitori della muffa (tegosept e acido propionico) in combinazione e separatamente, provando diverse concentrazioni, erano tutti tossici per B. coprophila a livelli che inibiscono la muffa. L’agar deve avere un pH compreso tra 6 e 7 (neutro) poiché B. coprophila si ammala a pH acido (come con l’acido propianico). In alternativa, per ovviare all’alimentazione tre volte alla settimana, ha provato a usare una spatola o una siringa senza ago per erogare una densa pasta di lievito (lievito secco attivo Red Star mescolato con un po’ di acqua distillata per inumidirlo) come una cucchiaiata sopra l’agar in ogni fiala una settimana dopo l’accoppiamento (cioè, circa nel momento in cui le larve inizieranno ad emergere).

Un altro metodo per evitare l’alimentazione tre volte alla settimana è aggiungere una coltura vivente di funghi a ciascuna fiala. Bath e Sponsler³⁷ hanno riportato che una superficie inclinata di agar con il terreno di Sabouraud dovrebbe essere striata con una coltura fungina dei generi Chaetoconidia (migliore) o altrimenti Baplosporangia o Xllescheria. Il fungo è stato coltivato da diversi giorni a una settimana prima dell’introduzione di B. coprophila . Dopo questo non è stato necessario nutrire. Una variante di questo metodo è stata impiegata anche da Ellen Rasch (comunicazione personale). Nelle nostre mani, le fiale erano troppo bagnate con questo metodo e le larve sono annegate, ma si potrebbe riprovare per ottimizzare il numero di larve rispetto alle fiale con funghi vivi.

Arthur Forer (comunicazione personale) ha avuto un certo successo nell’allevamento di B. coprophila allo stesso modo delle mosche della gru³⁸. Con questo approccio, le pupe venivano allevate su cartapesta umida. Successivamente, gli adulti venivano accoppiati e le uova venivano depositate su cartapesta fresca e umida. Le larve risultanti sono state mantenute in cartapesta in piastre di Petri e nutrite con foglie di ortica in polvere due volte a settimana. Le pupe venivano messe in una gabbia per ripetere il ciclo.

Yukiko Yamashita (comunicazione personale) ha cercato senza successo di allevare B. coprophila sul terreno, imitando le condizioni in cui si trovano in natura nelle piante in vaso e nelle serre con elevata umidità. Tuttavia, la muffa può diventare un problema quando il livello di umidità aumenta. Ciononostante, il terreno umido è stato utilizzato con successo per allevare larve di Pseudolycoriella (precedentemente Bradysia) hygida in scatole di plastica con terreno umido; vengono nutriti con foglie decomposte di Ilex paraguariensis, integrate nella tarda vita larvale con estratto di lievito all’1,2%, amido di mais all’1,4%, farina d’avena allo 0,8%, agar^{12 all’1,2}%. Allo stesso modo, il terreno umido può essere sostituito da muschio di torba umido con fagioli frantumati per allevare mosche sciaridie^39,40.

Altri metodi ancora sono stati impiegati per mantenere le colture di laboratorio di Bradisia: (i) patata autoclavata a cui vengono aggiunti lievito e fertilizzante ematico essiccato⁴¹; ii) letame 42,43,44 a cui può essere aggiunto sangue secco ⁴⁵; iii) contenitori di plastica con dischetti di cotone e tovaglioli di carta inumiditi con semi di soia macinati⁴⁶.

Acari
Gli acari possono essere trasferiti da Drosophila a B. coprophila. Per ridurre al minimo questo problema, è meglio tenere B. coprophila in un’incubatrice o in una stanza separata, non vicino alle scorte di Drosophila. Inoltre, eseguire qualsiasi lavoro di manutenzione di B. coprophila all’inizio della giornata prima di maneggiare Drosophila. Gli acari possono anche essere trasferiti a B. coprophila dalle piante d’appartamento, quindi non tenere le piante nella stessa stanza di B. coprophila. Se gli acari invadono le fiale, possono essere visti come piccoli organismi sferici bianchi che strisciano sul corpo di B. coprophila. I trattamenti chimici che lavorano per distruggere gli acari in Drosophila non possono essere utilizzati per B. coprophila poiché le sostanze chimiche uccidono B. coprophila (B. coprophila è anche sensibile ai fumi organici come il fenolo). L’unico trattamento per liberare le scorte di B. coprophila dagli acari è quello di raccogliere manualmente gli embrioni su una piastra di acar, esaminare ciascuno per l’assenza di acari e quindi trasferirli in fiale di agar fresche usando un pennello fine. I tappi di garza riempiti di cotone e i flugs in schiuma di acetato di cellulosa (come quelli utilizzati per le fiale di polipropilene Drosophila) aiutano entrambi a prevenire l’ingresso di acari nelle fiale.

Utilità dei protocolli di allevamento
I protocolli qui descritti consentiranno alla crescente comunità di scienziati di allevare B. coprophila come un nuovo/vecchio organismo modello emergente per studiare le sue caratteristiche biologiche uniche. Nuovi gruppi di laboratorio sono incoraggiati a unirsi alla comunità in crescita per mantenere e studiare le caratteristiche biologiche uniche della Bradisia (Sciara).

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Un ringraziamento speciale ai precedenti allevatori di B. coprophila (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) e al personale di ricerca (in particolare Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto) per aver messo a punto i protocolli di allevamento. Le istruzioni iniziali sulla cura di B. coprophila sono state fornite da Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz ed Ellen Rasch. Con gratitudine a Yukiko Yamashita e Anne W. Kerrebrock per aver rilevato il centro di stoccaggio Bradysia (Sciara). Molto apprezzamento alle seguenti persone per la loro utile preparazione delle figure: Brian Wiegmann (Figura 1), John M. Urban (Figura 4 pannello superiore), Laura Ross (Figura 4 pannello inferiore), Yutaka Yamamoto (Figura 5 pannello di sinistra), Leo Kadota (Figura 7 e Figura 8). Ringraziamo Ava Filiss e il Brown University Multidisciplinary Laboratory per il loro aiuto nella fotografia e nelle riprese. Grazie a Robert Baird per i commenti su questo manoscritto. La nostra ricerca e il mantenimento di B. coprophila sono stati supportati da NIH e NSF, incluso il più recente supporto da NIH GM121455 a S.A.G. Ulteriori dettagli su B. coprophila sono disponibili sui siti web del Centro di Stoccaggio Bradysia (Sciara) (https://sites.brown.edu/sciara/ e https://sciara.wi.mit.edu) attualmente in fase di costruzione.

Materials

Agar (bacteriological)	U.S. Biological	A0930	https://www.usbio.net;
CO₂ FlyStuff Foot Pedal	Genesee Scientific	59-121
CO2 FlyStuff Blowgun	Genesee Scientific	54-104
CO2 FlyStuff UltimaterFlypad	Genesee Scientific	59-172	https://www.geneseesci.com
Ether fume hood	Labconco	3955220	Sits on top of lab bench
			Filter replacement cat # 6961300
Food: Brewer’s Yeast Powder	Solgar		Obtain from Amazon or health food store
			https://www.solgar.com;
Food: Nettle Powder (pesticide free)	Starwest Botanicals	209460-51
Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)	Starwest Botanicals	202127-5	https://www.starwest-botanicals.com;
Food: Spinach Powder ( pesticide free)	Starwest Botanicals	209583-5
Food: Straw (pesticide free )	Starwest Botanicals	209465-3
Jar: clear glass, polypropylene lid	Fisher Scientific:	FB02911765	73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) https://www.fishersci.com;
Needle Probe, wooden handle	US Geo Supply Inc	SKU: 4190	5.75” long probe, stainless steel needle https://usgeosupply.com; (970)-434-3708
Vials: glass, preferred:	Wilmad LabGlass
Wilmad-glass custom vials			28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com
Vials: glass (cheaper and ok)	Fisher Scientific	03-339-26H	29 mm outer dia, 9.5 cm h https://www.fishersci.com;
Vials: glass (a bit narrow)	Genesee Scientific	32-201	24.5 mm outer dia,9.5 cm h thttps://www.geneseesci.com
Vials: polypropylene	Genesee Scientific	32-114	28.5 mm outer dia,9.5 cm ht
Vial Plugs
roll of non-absorbent cotton	Fisher Scientific	22-456881
cheesecloth	Fisher Scientific	22-055053	https://www.fishersci.com;

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Bradysia (Sciara) Coprophila Lower Dipteran Fly Laboratory Maintenance Monopolar Spindle Chromosome Imprinting Germ Line-limited Chromosomes Chromosome Elimination Sex Determination DNA Amplification Genome Sequencing Transformation Methodology Phenotypic Markers Mass Mating Embryo Hatch Larval Feeding

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記事を引用

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Manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori Bradysia (Sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente