このプロトコルは、ヒト腸オルガノイド技術とシングルセルトランスクリプトーム解析を組み合わせて、これまで未踏の腸内生物学に関する重要な洞察を提供します。
シングルセルトランスクリプトミクスは、人体の細胞生物学の理解に革命をもたらしました。最先端のヒト小腸オルガノイド培養は、動物モデルと臨床研究の間のギャップを埋める ex vivo モデルシステムを提供します。シングルセルトランスクリプトミクスをヒト腸オルガノイド(HIO)モデルに応用することで、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学が明らかになりました。高度なシングルセルトランスクリプトミクスプラットフォームは、マイクロ流体分割とバーコードを使用してcDNAライブラリを生成します。これらのバーコード付きcDNAは、次世代のシーケンシングプラットフォームで簡単にシーケンシングでき、さまざまな視覚化ツールでマップを生成するために使用できます。ここでは、ヒト小腸HIOをさまざまな形式で培養および鑑別する方法と、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームでの使用に適したこれらのフォーマットから生細胞を単離する手順について説明します。これらのプロトコルおよび手順は、小腸HIOの使用を促進し、さまざまな異なる環境の文脈における転写レベルでのヒト腸上皮の細胞応答の理解を深めることができます。
小腸上皮には、腸幹細胞(ISC)を収容する陰窩と、分泌系統と吸収系統の分化細胞で構成される絨毛の2つの異なるゾーンがあります。この複雑さに加えて、上皮の局所特異性があり、小腸の領域間に独自の機能特性を提供します。先駆的な研究により、ヒトの小腸陰窩と絨毛ゾーンの両方を手術組織または組織生検から 生体外で 生成できる培養条件が確立されました1。これらの培養物は、動物実験と臨床試験の間のギャップを埋め、これまで認識されていなかった消化管の細胞生物学、生化学、生理学を明らかにしています。HIOは、幹細胞の生存率を促進する成長因子と細胞外支持マトリックスを備えた培地を使用して、3D球状構造として増殖します。これらの条件により、主に前駆細胞と幹細胞で構成される陰窩のようなHIOモデルが得られます。成長因子の除去は、ISCの分化(絨毛様モデル)と成熟腸上皮細胞(杯、腸内分泌、房、腸細胞)の適切な比率での産生を促進し、細胞の増殖と分化、分極、バリア完全性、局所特異的特徴、および適切な生理学的応答とともに促進します2.HIO培養物は遺伝的に安定しており、陰窩のような状態で無期限に増殖することができます。これらの培養物の頂端表面への容易なアクセスは、単層フォーマット3での増殖を可能にする培養条件によって提供されます。HIOはまた、遺伝学、年齢、性別、民族性、疾患状態などの宿主の個体差の考慮を生物学的分析に含めることを可能にします。分析的および機能的評価ツールは、形質転換細胞株を中心としたアプローチで使用されるものと同じであり、フローサイトメトリー、顕微鏡法、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクスなどのさまざまな分子技術が含まれます。
シングルセルトランスクリプトミクスは、各細胞タイプの生物学的プロセスへの個々の寄与についての洞察を提供することにより、小腸の生物学と生理学の理解に革命をもたらしています。この技術を用いた先駆的な研究は、天然のヒト腸内に存在する細胞型の風景を提供してきた4,5,6。シングルセル転写プロファイリングプラットフォームは、個々の細胞の転写ランドスケープの探索を可能にし、細胞の不均一性を科学的探索の最前線に浮かべることができます。一部のシングルセル転写プロファイリングプラットフォームでは、マイクロ流体分割とバーコード化を使用して、サンプルあたり最大10,000個の細胞から得られた細胞ポリアデニル化mRNAからcDNAライブラリを生成します。このプラットホームでは、単一細胞、バーコード付きオリゴヌクレオチド、逆転写試薬、および油を含む液滴が反応小胞を形成し、その結果、同じバーコードを持つ単一細胞からのすべてのcDNAが得られます。バーコード化されたcDNAは、次世代シーケンシングを使用して効率的にシーケンシングできます。生成されたデータは、バーコード化された配列を視覚化マップと単一細胞転写プロファイルに変換するソフトウェアと視覚化ツールで処理できます。細胞集団は、ヒト小腸上皮の公開データベースを使用して同定できます4,5,6。このプラットフォームを利用してマウスの腸オルガノイドをシングルセルレベルで調べる研究は数多くありますが、HIOのシングルセル転写応答の解析は7,8,9,10,11,12に遅れをとっています。
ここでは、小腸のHIOから生細胞を単離し、シングルセル転写プロファイリングプラットフォームで処理するためのステップバイステップのガイドを提供します(図1)。培養と分化のガイドラインと、上皮分化に最適化された培地成分を提供します。ここでは、プラスチックまたは膜細胞培養インサート上での3次元(3D)培養および単層培養の3つの異なる培養フォーマットの細胞回収方法の概要を説明します。オープンソースソフトウェアを用いて得られたクラスタリングデータのサンプルを提供し、各クラスターで発現差のある遺伝子を導出します。
シングルセルゲノミクスプラットフォームを使用すると、腸上皮をモデル化する組織由来のHIO培養物などの複雑な生物学的システムを分解して、全体的な生物学的応答に対する個々の細胞の寄与を得ることができます4,5,6。細胞の不均一性や希少な細胞集団も同定し、調査することができます。シングルセルトランスクリ?…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、U19 AI157984、U01 DK103168、U19 AI144297、P30 DK56338、P01 AI057788、U19 AI116497助成金、および NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A を認めています。
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | 10 nM |
0.05% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
0.4% Trypan blue | Millipore-Sigma | T8154 | |
0.5 M EDTA | Corning | 46-034-CI | |
1x PBS Ca- Mg- | Corning | 21-040-CM | |
24 mm Transwell | Costar | 3412 | |
24 well Nunclon delta surface tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
40 µm Flowmi tip strainer | SP Bel-Art Labware | H13680-0040 | |
70 µm Flowmi tip strainer | SP Bel-Art Labware | H13680-0070 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
A-83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1X |
Chromium Next GEM Single Cell 3’ GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 | 10x Genomics | PN-1000128 | |
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | 33 µg/mL |
Corning Cell Recovery Solution | VWR | 354253 | |
DPBS (Mg2-, Ca2-) | Invitrogen | 14190-136 | 1X |
GlutaMAX-I | Invitrogen | 35050-061 | 2 mM |
HEPES 1M | Invitrogen | 15630-080 | 10 mM |
L-WRN conditioned media | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel, GFR, phenol free | Corning | 356231 | |
mouse recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | 50 ng/mL |
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1X |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | 500 µM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 10 µM |
Transwell | Corning | 3413 | |
Y27632 | Stem Cell Technologies | 72308 | 10 µM |