両親媒性DNAナノスターからなる合成生体分子凝縮体を、その構成DNAオリゴヌクレオチドから調製するためのプロトコールを提示します。縮合物は、単一のナノスター成分または2つの成分から産生され、埋め込まれたDNAテンプレートからのRNAの in vitro 転写を維持するように修飾されます。
合成液滴や凝縮物は、高度な生体模倣システムや合成細胞の成分としてますます一般的になりつつあり、それらを使用して区画化を確立し、生命のような応答を維持することができます。合成DNAナノ構造は、そのプログラム可能な形状、化学的官能基化、および自己組織化挙動により、凝縮物形成ビルディングブロックとして大きな可能性を示しています。私たちは最近、DNA結合部を疎水性部分で標識することによって得られる両親媒性DNA「ナノスター」が、特に堅牢で汎用性の高い溶液を構成することを実証しました。得られた両親媒性DNA凝縮体は、複雑なマルチコンパートメントの内部構造を示し、さまざまな外部刺激に構造的に応答し、高分子を合成し、ペイロードを捕捉して放出し、形態学的形質転換を受け、生細胞と相互作用するようにプログラムできます。ここでは、構成DNAオリゴヌクレオチドから始まる両親媒性DNA凝縮体を調製するためのプロトコルを示します。(i)均一な凝縮体を形成する単一成分システム、(ii)コアシェル凝縮体を形成する2成分システム、および(iii)凝縮物がRNAナノ構造の in vitro 転写をサポートするために修飾されるシステムについて説明します。
合成細胞は、現存する生体細胞の機能や構造を再現するためにボトムアップで構築されたマイクロメートルスケール(10-50μm)のデバイスです1,2。合成細胞は、脂質二重層小胞3,4,5,6,7、ポリマーソーム8,9、またはプロテオソーム10,11から構築された膜によって結合されることが多く、これらは内部区画化12,13を確立するためにも使用できます。生細胞14で様々な機能を維持することが知られている膜のないオルガネラに触発されて、ポリマーコアセルベイト、生体分子縮合物、およびハイドロゲルなどの構造は、合成細胞15,16,17,18における外部および内部の区画化を確立するための多用途で堅牢な代替手段として注目を集めている。
DNAナノテクノロジー19の汎用性の高いツールキットを活用して、人工DNAナノ構造の自己組織化から合成液滴および凝縮物を設計するための複数のソリューションが開発されており、そのサイズ、形状、機能、価数、および相互相互作用を正確にプログラムすることができる20。DNAの液滴または凝縮物は生体適合性があり、合成細胞および細胞小器官の両方の足場として機能し、化学反応および生体分子反応21をホストし、情報22,23を計算し、貨物を捕捉および放出24,25し、構造応答26を維持することができる。
凝縮物形成DNAナノ構造の多様な設計の中で、両親媒性DNAナノスター(Cスターと呼ばれる)は、堅牢で汎用性が高いことが証明されています27。C-スターは、固定されたDNA結合(通常は4方向)からなる単純な分岐モチーフであり、そこから二本鎖(ds)DNAアームが出現する28。次に、アームの先端に疎水性部分(通常はコレステロール)が埋め込まれ、ナノ構造が両親媒性になり、単純なワンポットアニーリング後にそれらの凝縮が促進されます。C-スター縮合体は、マルチコンパートメントアーキテクチャ29,30の確立、DNAおよびカチオントリガー31に対する構造的応答、高分子の合成29、ペイロード32の捕捉および放出、および生細胞33との相互作用の可能性を含む、正確な構造的および機能的プログラマビリティを提供する.以下では、C-star縮合物をその構成オリゴヌクレオチドから生成するためのプロトコルについて説明し、説明します。
このプロトコールは、単項(1成分)およびバイナリ(2成分)凝縮体の調製をまとめたもので、3つの異なるC-starデザイン(図1)を利用して、「非応答性」、「TMSD-応答性」、「RNAテンプレート化」を行います。「無反応」C-star(パネルA)は、4方向の接合を形成する異なる配列を持つ4つの「コアストランド」で構成されています。4つの同一のコレステロール修飾オリゴヌクレオチドが接合部に接続されており、各アームの末端にコレステロール分子が存在することが保証されます。応答しないC-starは、単項およびバイナリ凝縮体のための単純で不活性な足場を構成します。「TMSD-responsive」C-star(パネルB)では、コレステロール化された鎖と接合部との間の接続は、ぶら下がっている一本鎖(ss)DNAの「toehold」ドメインを特徴とする「Toeholding bridge」鎖によって確保されています。相補的なトーホールドドメインを有する侵入者DNA鎖の存在下では、トーホールド媒介鎖置換反応が引き起こされ得る34、これにより、侵入者はトーホールドブリッジを置換し、ジャンクションと疎水性部分との間の接続を切断し、DNAネットワークの分解を誘発する32。最後に、「RNAテンプレート」C-star(パネルC)は、「ブリッジ」鎖に相補的な「塩基」修飾を含み、後者はブロッコリーアプタマー29の転写可能なssDNAテンプレートをリンクします。ここで言及されている3種類のC-starデザインの構成オリゴヌクレオチドの配列詳細は、補足表1および以前の研究29,30,32に記載されています。
図 1.両親媒性DNAナノスター(C-stars)の3つの異なるデザインの概略図。 ここで説明したC-starのさまざまな例のオリゴヌクレオチド配列は、 補足表1に記載されています。(A)成分オリゴヌクレオチド鎖「Core 1」、「Core 2」、「Core 3」、「Core 4」(ピンクの色合い)および「末端コレステロール」(青色)を含む、非応答性凝縮体を形成するように設計されたC-starの概略図。それぞれの固有の色は、固有の配列のオリゴヌクレオチド鎖を表します。”Core 1″ と “Core 3” は、それぞれ “Core 2” と “Core 4” と部分的に相補的ですが、互いに相補的ではありません。(B)前の研究32で説明したように、つま先を介したストランドの変位を介して侵入するストランドが追加されると分解するように設計されたCスターの概略図。このC-starは、「コア」と「末端コレステロール」の鎖(灰色で表示)、「末端補体」(オレンジで表示)と「つま先保持ブリッジ」の鎖(濃い青緑色で表示)で構成されています。後者には6ヌクレオチドのオーバーハングが含まれており、適切に設計されたインベーダー鎖が「トーホールディングブリッジ」鎖と結合し、その後完全に置換することができ、これにより中央のナノスター接合部(「コア1、2、3、および4」で構成される)が「末端補体」および「末端コレステロール」鎖で構成される二本鎖から解離します。(C)RNAアプタマーのDNAテンプレートで官能基化されたC-starの概略図。これも、「末端コレステロール」鎖と「コア2、3、4」(すべて灰色で表示)のほか、「コア1」鎖(ピンクで表示)の拡張バージョン、「ベース」鎖(茶色)、「ブリッジ」鎖(黄色)、および「アプタマーテンプレート」(緑)で構成されています。後者の2本の鎖で構成されるDNA二本鎖は、転写開始部位を示すT7ポリメラーゼプロモーター領域を形成します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
C-スター縮合物は、構成オリゴヌクレオチドの熱アニーリングによって形成され、ここで提示するプロトコールでは、高アスペクト比の長方形断面を有する密閉ガラスキャピラリー内で行われます。これらの容器には、複数の重要な利点があります: i) シーリングにより、(時には遅い)アニーリングステップで蒸発が完全に防止されます。ii)キャピラリーの光学品質の平底により、自己組織化(または分解)過渡現象のイメージングが可能になります。iii)キャピラリーの高いアスペクト比により、重い凝縮物が広く平らな領域に沈殿し、くさび形の容器(マイクロ遠心チューブなど)で発生する自己組織化過渡現象の後の段階での合体と凝集の可能性が減少し、比較的単分散の凝縮物集団が生成されます。iv)細長いガラスキャピラリーでアニーリングを行うことで、両親媒性コレステロール化されたオリゴヌクレオチドを動員することにより自己組織化を乱すことが観察されている疎水性界面(空気、プラスチック、または油)へのサンプルの曝露を最小限に抑えます。アセンブリプロトコルが完了すると、ガラスキャピラリーから凝縮物を抽出して、追加の試薬を含むさらなる実験を行うことができます。
ここで説明するプロトコルは、両親媒性DNAナノスターから1成分または2成分の凝縮物を調製するためのアプローチを提供し、凝縮物に異なる応答を導入するための設計バリエーションを備えています。所与のプロトコルは、TE中の0.3 M NaClの緩衝液中で縮合物を生成しますが、上記の容量を適切に変更することにより、緩衝条件を修正することができます。以前の研究では、TEの0.2 M NaCl、TEの0.1…
The authors have nothing to disclose.
LM、LDM、DTは、Horizon 2020 Research and Innovation Programme(ERC-STG No 851667 – NANOCELL)の下での欧州研究会議(ERC)からの支援を認めています。LDMは、Royal Society Research Grant for Research Fellows(RGF/R1/180043)からの支援と、Royal Society University Research Fellowship(UF160152、URF/R/221009)からの支援を認めています。
0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | SLGVR33RB | |
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | VWR | 631-0853 | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34683 | |
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC | Cole-Parmer | WZ-08895-11 | |
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue | RS | ARA-400005 | |
Bio-Rad C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid | Fisher Scientific | 15338665 | 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates |
Diamond Scribing Pen | RS | 394-217 | |
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 0030123301 | 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures |
Ethanol Absolute 99.8+% | Fisher Scientific | 10437341 | 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes |
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer | Fisherbrand | 13284769 | |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length | CM Scientific | 2540-50 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | 69794 | |
Mini Centrifuge, 230 V | PRISM(TM) | Z763128 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Custom | Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required. |
ScriptGuard RNase inhibitor | CELLSCRIPT | C-SRI6310K | RNase inhibitor |
T7-FlashScribe Transcription Kit | Cambio | C-ASF3507 | |
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution | Sigma-Aldrich | 574793 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977035 | |
VWR Spec-Wipe 3 Wipers | VWR | 21914-758 |