Naegleria gruberi rDNAのN. gruberi Trophozoiteesへの分子クローンのトランスフェクション
概要
このプロトコルは、 Naegleria gruberi trophozoitesをトランスフェクションする方法を、 in vitroで、またエンシストおよびエクスチストメントを通じて、トランスフェクションするコンストラクトを説明しています。
Abstract
Naegleria trophozoitesのすべてのリボソーム遺伝子は、閉じた環状染色体外リボソームDNA(rDNA)を含む要素(CERE)に維持されています。CEREについてはほとんど知られていませんが、Naegleriaの3種の完全なゲノム配列解析により、核ゲノムにはrDNAシストロンが存在しないことが明確に示されています。さらに、N. gruberi CEREでは、単一のDNA複製起点がマッピングされており、CEREが核ゲノムとは無関係に複製するという仮説を支持しています。このCEREの特性は、遺伝子操作されたCEREを使用してNaegleria trophozoitesに外来タンパク質を導入することが可能であることを示唆しています。NaegleriaにおけるCEREのベクターとしての利用を検討する最初のステップとして、我々は、N. gruberiの分子クローンをpGEM7zf+(pGRUB)にクローニングしたN. gruberiの分子クローンと共にN. gruberiにトランスフェクションするプロトコルを開発しました。トランスフェクション後、pGRUBはN. gruberi trophozoitesにおいて、少なくとも7回の継代、ならびに包嚢および排泄を通じて容易に検出されました。対照として、栄養型株にバックボーンベクターpGEM7zf+をトランスフェクションし、N. gruberi配列(pGEM)を使わずにトランスフェクトしました。pGEMは、N. gruberiへのトランスフェクション後の最初の通過後には検出されず、真核生物では複製できないことを示しています。これらの研究では、Naegleria trophozoitesのトランスフェクションプロトコルについて説明し、pGRUBの細菌プラスミド配列がトランスフェクションされたCEREクローンのトランスフェクションと複製の成功を阻害しないことを示しています。さらに、このトランスフェクションプロトコルは、栄養型でのCEREの複製を促進する最小配列を理解するだけでなく、非リボソーム配列(NRS)の調節領域を同定する上でも重要です。
Introduction
Naegleria属には45種以上が含まれていますが、種のすべてのメンバーが特定されている可能性は低いです1。ネグレリアは、栄養型(アメーバ)、鞭毛虫、または資源が厳しく制限されている場合は嚢胞1,2,3,4として、さまざまな形で存在することができます。Naegleria属は、その特に危険な種であるNaegleria fowleri(脳を食べるアメーバ)(1,2,3,4,5,6,7でレビュー)として知られることで認識されており、これはほぼ普遍的に致命的な原発性アメーバ性髄膜脳炎の原因です。
Naegleriaは、核小体にあるCERE上にrDNAをコードします。Naegleriaの3種のゲノムの完全なシーケンシングにより、核ゲノム8,9,10,11にrDNAが存在しないことが確認された。限られた完全長のCERE配列に基づくと、CEREの長さは約10 kbpから18 kbpの範囲です。Naegleriaの各種のCEREは、細胞12,13,14あたり約4,000のCEREのそれぞれに単一のrDNAシストロン(5.8、18、および28SリボソームDNAを含む)を持っています。rDNA以外に、各CEREは大きな非rDNA配列(NRS)を持っています。CEREのサイズは種によって異なります。この違いは主にNRSの長さが異なることによるもので、rDNA配列は1,15,16,17,18,19,20属にわたって高度に保存されています。N. gruberi CERE NRS21内のDNA複製の単一起源のマッピングは、Naegleria CEREが核ゲノムとは無関係に複製するという仮説を強力に支持する。
N. gruberiは、Naegleriaの生物学の研究によく使用される非病原性アメーバです。私たちは、Naegleria amoebaeが栄養型内でCEREを許容し、独立して複製するという仮説を検証するために、N. gruberiの栄養型を同種のCEREクローンで形質転換する方法論を開発しました。これは、N. gruberi CEREの完全長クローンを持つN. gruberiを栄養型に形質転換し、ドナーCEREクローンの運命をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって追跡することによって達成されました。このプロトコルの一般的な概要を図 1 に示します。本明細書に提示されたデータは、ドナークローンが組織培養中の少なくとも7つの継代を通じて検出され得ること、ならびに包嚢および排泄を通じて維持され得ることを実証している。これらの研究は、CEREがどのように複製するかを解剖する手段の基礎を形成するとともに、Naegleriaをトランスフェクトするためのベクターとしての使用を探求します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで概説するプロトコルは非常に単純ですが、すべてのコンストラクトは、コンストラクトの性質および使用される Naegleria の種に応じて、特にDNAトランスフェクション試薬比について、ある程度の最適化を必要とする可能性があります。このプロトコルを使用して試験した市販のトランスフェクション試薬は1つだけですが、他のいくつかの試薬が効果的である可能性があります。C…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの研究は、クレイトン大学(KMD)のGeorge F. Haddix Fundからの助成金によって部分的に資金提供されました。 図 1 は biorender.com で生成され、 図 3 は benchling.com で生成されます。
Materials
| Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | A-7330 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C-4901 | |
| Crushed ice | |||
| Culture Flasks, T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
| Culture Plate, 6-well | Corning | 3506 | |
| DNAse | Sigma Aldrich | D-4527 | |
| EDTA, 0.5 M | Affymetrix | 15694 | |
| Electropheresis Gel Apparatus | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Tubes, 2 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
| Ethidium Bromide | Sigma Aldrich | E-8751 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | |
| Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
| GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | UN2789 | |
| GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Heating Block | Thermo Scientific | 88871001 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
| Iron Chloride | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
| Ligase | NEB | M2200S | |
| Magneisum Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Microfuge | Thermo Scientific | MySpin 12 | |
| Microscope | Nikon | TMS | |
| N. gruberi | ATCC | 30224 | |
| Nucleic Acid | Chem Impex Int’l | #01625 | |
| Peptone | Gibco | 211677 | |
| pGEM | Promega | P2251 | |
| Potassium Phosphate | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
| PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit | Bio Rad | 1645052 | |
| Sodium Chloride | MCB Reagents | SX0420 | |
| Sodium Phosphate, dibasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Tabletop Centrifuge | eppendorf | 5415R | |
| Tris, base | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
| Trypan Blue, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| ViaFect Reagent | Promega | E4981 | |
| Weigh Scale | Denver Instruments | APX-60 | |
| Yeast Extract | Gibco | 212750 |
参考文献
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