概要

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

Published: November 15, 2024
doi:

概要

このプロトコルは、酵素解離および蛍光活性化細胞ソーティングによるトゲマウス(Acomys)からの骨格筋および心筋線維脂肪形成前駆細胞(FAP)の単離を概説しています。このプロトコルから得られたFAPは、筋線維芽細胞および脂肪細胞に効果的に拡大および分化させることができます。

Abstract

その優れた修復プログラムにより、トゲネズミは再生医療の新たな研究モデルとなっています。線維脂肪形成前駆細胞は、脂肪細胞、線維芽細胞、軟骨細胞に分化することができる組織に常在する細胞です。線維脂肪形成前駆細胞は、損傷後の細胞外マトリックスリモデリングに関与しているため、組織再生を組織再生するための基本です。この研究は、トゲトゲマウスの心臓修復と骨格筋の再生における線維脂肪形成前駆細胞の特定の役割を調査することに焦点を当てています。この目的のために、酵素的に解離した骨格筋および心筋からのフローサイトメトリーによるトゲマウス線維脂肪形成前駆細胞の精製のためにプロトコルが最適化されています。このプロトコルから得られた集団は、 in vitro で拡大することができ、筋線維芽細胞および脂肪細胞に分化することができる。このプロトコールは、研究者がトゲネズミの特徴的な特性を調べ、 それらをMus musculus と比較するための貴重なツールを提供します。これにより、この興味深いモデルにおける再生メカニズムの理解を進める可能性のある洞察が得られます。

Introduction

当初、非常に壊れやすい皮膚と皮膚の損傷を修復する優れた能力で認識されていたトゲマウスは、Mus musculus 1,2と比較して、筋骨格系、腎臓系、中枢神経系、心血管系などのさまざまな臓器系で優れた再生能力を示しています。

線維脂肪形成前駆細胞(FAP)は、骨格筋や心筋などのさまざまな組織に存在する間質細胞のサブセットです。これらの細胞は、in vivoおよびin vitroで線維形成および脂肪形成の系統に関与する独自の能力を持っています3,4。FAPは、細胞外マトリックスを調節し、修復プロセスに関与する他の細胞タイプの機能をサポートすることにより、組織再生に重要な役割を果たします。骨格筋では、FAPは損傷に応答して活性化し、筋幹細胞の分化と筋形成を促進します5,6。心臓の虚血性損傷では、FAPは心筋の完全性を維持するために瘢痕組織を敷設します。筋肉とは対照的に、心臓のFAPは慢性的に活性化され、病理学的リモデリングに寄与します7,8

これまでの研究では、トゲネズミの細胞外マトリックスは、Mus musculus 9,10と比較して、再生をサポートする組成、構造、および特性が異なることが示されています筋肉および心臓の損傷では、FAPはとげのあるマウス11,12,13の優れた治癒に寄与することが注目されています。トゲトゲマウスのFAPと間質の行動と制御制御を理解することで、その再生能力の背後にあるメカニズムに光が当てられる可能性があります。FAPは、mus musculus14,15などの他の動物モデルで広く研究されていますが、現在、とげのあるマウスのFAPを分離するための公開されたプロトコルはありません。このようなプロトコルを開発すれば、この分野の大きなギャップを埋めることができ、研究者はトゲネズミの再生能力の根底にある細胞および分子メカニズムを調べることができます。

このプロトコルは、とげのあるマウスから骨格筋および心筋のFAPを分離、拡張、および区別するための堅牢で再現性のあるプロトコルを説明しています。ここで説明するプロトコールは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)に適した高品質のシングルセル懸濁液をもたらします。rh−TGFβ1または適合する市販培地、すなわち筋FAP16を鑑別するために広く使用されている2つの方法を使用することにより、選別されたトゲ状FAPは、それぞれ線維形成系統および脂肪形成系統に沿って分化する能力を維持する(図1)。

Protocol

すべての動物の維持管理および実験手順は、ブリティッシュコロンビア大学動物管理委員会の承認およびブリティッシュコロンビア大学の規則に従って実施されました。動物は、標準的な条件(12:12明暗サイクル、21-23°C、湿度40%-60%)で病原体のない密閉施設に収容され、タンパク質が豊富なマウスの食事 と水を自由に提供しました。この研究には、成体(生後4?…

Representative Results

骨格筋と心臓のFAPを分離して培養するためのこのプロトコルの概略図を 図1にまとめています。組織採取の場合、肝臓の色が濃い赤から淡い黄色に変わることは、通常、灌流が成功したことを示しています。とげのあるマウスの指定された年齢範囲では、心臓の重量は通常約200 mgですが、大腿四頭筋は約350 mgです。 ステッ?…

Discussion

トゲネズミ組織は、組織解離のストレスに対してより敏感であり、このプロトコルには、ストレスを最小限に抑えて細胞の生存率を向上させることを目的としたいくつかの側面があります。サンプル調製には、必要な酵素の濃度を下げるためのシリアル酵素解離技術が採用されています。酵素消化が進むと、酵素活性は低下します。新鮮な酵素に置き換えることで、…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UBCフローコアのAndy Johnson氏とJustin Wong氏には、FACSプロトコルの最適化に関する専門知識と支援を提供していただき、また、UBC生物医学研究センターの動物施設スタッフのトゲネズミ治療にも感謝いたします。 図1 はBiorenderを使用して作成されています。 図2 はFlowJoソフトウェアを使用して作成されています。

Materials

0.5M EDTA Invitrogen 15575–038
1.7 mL Microcentrifuge tubes VWR 87003-294
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
20 mL syringe BD 309661
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D3571
40 μm cell strainer Falcon 352340
48 well flat-bottom tissue culture plate Falcon 53078
5 mL polypropylene Falcon 352063
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
5 mL syringe BD 309646
50 mL centrifuge tube Falcon 352070
60 mm Petri dish Falcon 353002
96 well V-bottom tissue culture plate Corning 3894
Acomys dimidiatus mice (spiny mice) kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky).
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer Gibco A10492-01
Anti-perilipin (1:100) Sigma P1873
Anti-SMA (1:100) Invitrogen 14-9760-82
APC PDGFRa (1:800) Abcam ab270085
BD PrecisionGlide Needle 18 G BD 305195
BD PrecisionGlide Needle 23 G BD 305145
Bovine serum albumin Sigma A7906-100g
BV605 CD31 (1:500) BD biosciences 744359
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Centrifuge Eppendorf 5810R
DMEM/F12 Gibco 11320033
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) Invitrogen A31570
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) Invitrogen A31573
Donkey serum Sigma S30-100ML
FACS sorter – MoFlo Astrios 5 lasers Beckman coulter B52102
Fetal bovine serum Gemini 100-500
Fine scissors FST 14058-11
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Forceps FST 11051-10
Hemostat FST 91308-12
human FGF-basic recombinant protein (bFGF) Gibco 13256029
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) eBiosciences 14-8348-62
Incubator – Heracell 160i CO2 ThermoFisher 51033557
Inverted microscope – Revolve ECHO n/a
Liberase Roche 5401127001
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement STEMCELL technologies 5507
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent Vector Laboratories MKB-2213
Paraformaldehyde Sigma P1648-500g
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140–122
PicoLab Mouse Diet 20 LabDiet 3005750-220
Propidium iodide (PI) Invitrogen P3566
Transport vial 5mL tube Caplugs Evergreen 222-3005-080
Triton X-100 Sigma 9036-19-5

参考文献

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記事を引用
Lin, B., Soliman, H., Rossi, F. M. V., Theret, M. Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model. J. Vis. Exp. (213), e66717, doi:10.3791/66717 (2024).

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