このプロトコルは、酵素解離および蛍光活性化細胞ソーティングによるトゲマウス(Acomys)からの骨格筋および心筋線維脂肪形成前駆細胞(FAP)の単離を概説しています。このプロトコルから得られたFAPは、筋線維芽細胞および脂肪細胞に効果的に拡大および分化させることができます。
その優れた修復プログラムにより、トゲネズミは再生医療の新たな研究モデルとなっています。線維脂肪形成前駆細胞は、脂肪細胞、線維芽細胞、軟骨細胞に分化することができる組織に常在する細胞です。線維脂肪形成前駆細胞は、損傷後の細胞外マトリックスリモデリングに関与しているため、組織再生を組織再生するための基本です。この研究は、トゲトゲマウスの心臓修復と骨格筋の再生における線維脂肪形成前駆細胞の特定の役割を調査することに焦点を当てています。この目的のために、酵素的に解離した骨格筋および心筋からのフローサイトメトリーによるトゲマウス線維脂肪形成前駆細胞の精製のためにプロトコルが最適化されています。このプロトコルから得られた集団は、 in vitro で拡大することができ、筋線維芽細胞および脂肪細胞に分化することができる。このプロトコールは、研究者がトゲネズミの特徴的な特性を調べ、 それらをMus musculus と比較するための貴重なツールを提供します。これにより、この興味深いモデルにおける再生メカニズムの理解を進める可能性のある洞察が得られます。
当初、非常に壊れやすい皮膚と皮膚の損傷を修復する優れた能力で認識されていたトゲマウスは、Mus musculus 1,2と比較して、筋骨格系、腎臓系、中枢神経系、心血管系などのさまざまな臓器系で優れた再生能力を示しています。
線維脂肪形成前駆細胞(FAP)は、骨格筋や心筋などのさまざまな組織に存在する間質細胞のサブセットです。これらの細胞は、in vivoおよびin vitroで線維形成および脂肪形成の系統に関与する独自の能力を持っています3,4。FAPは、細胞外マトリックスを調節し、修復プロセスに関与する他の細胞タイプの機能をサポートすることにより、組織再生に重要な役割を果たします。骨格筋では、FAPは損傷に応答して活性化し、筋幹細胞の分化と筋形成を促進します5,6。心臓の虚血性損傷では、FAPは心筋の完全性を維持するために瘢痕組織を敷設します。筋肉とは対照的に、心臓のFAPは慢性的に活性化され、病理学的リモデリングに寄与します7,8。
これまでの研究では、トゲネズミの細胞外マトリックスは、Mus musculus 9,10と比較して、再生をサポートする組成、構造、および特性が異なることが示されています。 筋肉および心臓の損傷では、FAPはとげのあるマウス11,12,13の優れた治癒に寄与することが注目されています。トゲトゲマウスのFAPと間質の行動と制御制御を理解することで、その再生能力の背後にあるメカニズムに光が当てられる可能性があります。FAPは、mus musculus14,15などの他の動物モデルで広く研究されていますが、現在、とげのあるマウスのFAPを分離するための公開されたプロトコルはありません。このようなプロトコルを開発すれば、この分野の大きなギャップを埋めることができ、研究者はトゲネズミの再生能力の根底にある細胞および分子メカニズムを調べることができます。
このプロトコルは、とげのあるマウスから骨格筋および心筋のFAPを分離、拡張、および区別するための堅牢で再現性のあるプロトコルを説明しています。ここで説明するプロトコールは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)に適した高品質のシングルセル懸濁液をもたらします。rh−TGFβ1または適合する市販培地、すなわち筋FAP16を鑑別するために広く使用されている2つの方法を使用することにより、選別されたトゲ状FAPは、それぞれ線維形成系統および脂肪形成系統に沿って分化する能力を維持する(図1)。
トゲネズミ組織は、組織解離のストレスに対してより敏感であり、このプロトコルには、ストレスを最小限に抑えて細胞の生存率を向上させることを目的としたいくつかの側面があります。サンプル調製には、必要な酵素の濃度を下げるためのシリアル酵素解離技術が採用されています。酵素消化が進むと、酵素活性は低下します。新鮮な酵素に置き換えることで、…
The authors have nothing to disclose.
UBCフローコアのAndy Johnson氏とJustin Wong氏には、FACSプロトコルの最適化に関する専門知識と支援を提供していただき、また、UBC生物医学研究センターの動物施設スタッフのトゲネズミ治療にも感謝いたします。 図1 はBiorenderを使用して作成されています。 図2 はFlowJoソフトウェアを使用して作成されています。
0.5M EDTA | Invitrogen | 15575–038 | |
1.7 mL Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
20 mL syringe | BD | 309661 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
48 well flat-bottom tissue culture plate | Falcon | 53078 | |
5 mL polypropylene | Falcon | 352063 | |
5 mL polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
5 mL syringe | BD | 309646 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
60 mm Petri dish | Falcon | 353002 | |
96 well V-bottom tissue culture plate | Corning | 3894 | |
Acomys dimidiatus mice (spiny mice) | kindly gifted by Dr. Ashley W. Seifert (University of Kentucky). | ||
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
Anti-perilipin (1:100) | Sigma | P1873 | |
Anti-SMA (1:100) | Invitrogen | 14-9760-82 | |
APC PDGFRa (1:800) | Abcam | ab270085 | |
BD PrecisionGlide Needle 18 G | BD | 305195 | |
BD PrecisionGlide Needle 23 G | BD | 305145 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906-100g | |
BV605 CD31 (1:500) | BD biosciences | 744359 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey anti-mouse Alexa 555 (1:1000) | Invitrogen | A31570 | |
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1:1000) | Invitrogen | A31573 | |
Donkey serum | Sigma | S30-100ML | |
FACS sorter – MoFlo Astrios 5 lasers | Beckman coulter | B52102 | |
Fetal bovine serum | Gemini | 100-500 | |
Fine scissors | FST | 14058-11 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Forceps | FST | 11051-10 | |
Hemostat | FST | 91308-12 | |
human FGF-basic recombinant protein (bFGF) | Gibco | 13256029 | |
Human TGF beta 1 recombinant protein (TGFb1) | eBiosciences | 14-8348-62 | |
Incubator – Heracell 160i CO2 | ThermoFisher | 51033557 | |
Inverted microscope – Revolve | ECHO | n/a | |
Liberase | Roche | 5401127001 | |
Mouse MesenCult Adipogenic Differentiation 10x Supplement | STEMCELL technologies | 5507 | |
Mouse on mouse (MOM) blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P1648-500g | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140–122 | |
PicoLab Mouse Diet 20 | LabDiet | 3005750-220 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
Transport vial 5mL tube | Caplugs Evergreen | 222-3005-080 | |
Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 |