概要

小葉全体のマウスにおける肺微小血管密度の定量化

Published: January 03, 2025
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概要

ここでは、イソレクチンB4の単一染色を使用して、マウス全体の肺組織の肺微小血管密度の偏りのない定量を行うためのシンプルで経済的なプロトコルについて説明します。

Abstract

肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害に関連しており、血管壁の完全性、血流調節、およびガス交換に深く関連しています。マウスモデルでは、肺葉のサイズ、形状、位置、血管新生に大きな違いが見られますが、既存の方法では微小血管密度を定量化する際のこれらの変動が考慮されていません。この制限は、肺の微小血管機能障害の包括的な研究と、さまざまな小葉にわたる微小血管系循環の潜在的なリモデリングを妨げます。私たちのプロトコルは、マウスの異なる葉にわたる気道枝のサイズ、形状、および分布を活用して、肺微小血管密度の変化を定量化するために 2 つの切片化方法を採用することにより、このギャップに対処します。次に、イソレクチンB4 (IB4)染色を利用して、さまざまなスライス上の肺微小血管内皮細胞を標識し、その後、無料で入手できるソフトウェアImageJを使用して偏りのない微小血管密度分析を行います。ここで紹介した結果は、若齢マウスと老齢マウスを比較して、老化に伴う肺小葉全体の微小血管密度の変化の程度が異なることを強調しています。このプロトコルは、肺微小血管密度の偏りのない定量化のための簡単で費用対効果の高いアプローチを提供し、肺微小血管系の生理学的側面と病理学的側面の両方に関する研究を促進します。

Introduction

内皮細胞(EC)は、血管の内層に位置する特殊なタイプの細胞で、動脈と静脈の樹全体を覆い、血管と臓器の安定性を維持する上で重要な役割を果たしています1。肺は高度に血管新生された器官であり、血管壁の形成、血流の調節、ガス交換の促進、炎症反応の調節、血小板活性の制御、血管の成長に関与する調節物質の分泌、修復、凝固バランスの維持など、肺で重要な生理学的および病理学的役割を果たします。

肺微小血管内皮細胞(LMEC)は、肺組織、特に肺の微小血管系(毛細血管)にある特定の内皮細胞であり、肺のより一般化された動脈および静脈内皮細胞と区別されます。これらの細胞は、血管緊張の調節、血管透過性の制御、炎症反応の調節への参加、血栓形成の調節など、さまざまな機能を持っています。それらは、肺循環、ガス交換、栄養素の輸送の調節に重要な役割を果たし、肺に関連するさまざまな生理学的および病理学的プロセスに関与していますまた、肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害と関連しています3。Larissa L.らは、従来の内皮細胞マーカーCD31と空間的局在化(具体的には肺の末梢領域)を用いて、老齢マウス(18ヶ月齢)の微小血管内皮細胞密度が若齢マウス(4ヶ月齢)と比較して有意に減少していることを観察しました4。喘息に関連する肺の病理の文脈では、Makoto H. et al. は、喘息患者からの抗コラーゲン IV で染色された気管支生検標本の血管誘導の大幅な増加を、対照被験者と比較して示しました5.最近、透過型顕微鏡と走査型電子顕微鏡の技術を導入することにより、Maximilian A. et al. は、Covid-19 または Influenza A (H1N1) で死亡した患者における腸感受性および発芽血管新生に関連する特徴の数値密度が著しく増加したことを報告しました6。明らかに、異常な微小血管の起源は肺の機能障害と関連しています。しかし、現在、微小血管密度の変化を定量化するための簡単で経済的な方法はありません。

マウスモデルでは、肺は従来、右頭蓋、右中央、右尾、左頭蓋、左尾の5つの異なる葉に分割されます。各葉は、サイズ、形状、位置、および血管新生の可能性に関して独自の特性を示し、効率的なガス交換と肺循環の潜在的に相乗的な調節に貢献します。しかし、私たちの知る限りでは、肺微小血管の変化を調査する際に、これらの肺葉の違いを説明する方法論はありません。

この研究は、肺微小血管密度の偏りのない定量的評価のために、肺微小内皮細胞7の明確なマーカーであるIB4を利用して、マウスで小葉を切片化する新しい方法を提示します。この革新的なアプローチは、マウスの個々の葉の明確な特性を考慮することにより、マウスの肺の微小血管の変化をより包括的に理解する必要性に対処します。デモンストレーションとして、老化マウスでは、肺の大幅な減少
微小血管密度は、尾葉と左葉の両方で特異的に観察されます。このプロトコルは、マウス肺の微小血管状況の変化の調査に葉特異的解析を統合することの重要性を強調しています。特に、この方法は、血管新生を超えて、肺の発達と病変の生理学的および病理学的進行の両方を包括的に理解しようとする研究者にとって貴重な研究参考文献を提供します。

Protocol

すべての実験は、四川大学動物研究委員会(No K2023023)の倫理ガイドラインに従って行われました。 1. マウス肺葉のパラフィン切片の作製 マウスから肺組織を採取します。6週目と16か月後の雄のC57Bl/6マウスを選択して、さまざまな年齢層のマウス肺の微小血管密度を評価します。 マウスの腹腔内注射により、100 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを投与します。.麻酔後に子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。胸腔を開き、肺組織を採取します。 パラフィン切片を調製します。組織の体積の10倍の4%パラホルムアルデヒド溶液に組織を固定することで、組織の形態と構造を維持し、劣化を防ぎます。注:マウスの肺の血管灌流固定中に空気を膨らませる最近の新しい方法が開発されました。この方法は、気道、肺胞細胞、および間質の形態と位置をより良く保存すると報告されており、肺の組織学的研究により適しています。この方法は、対応する機器と自社製の機器8を備えた消耗品を備えたラボに推奨されます。 肺葉を切開して、埋め込み方向を決定します(図1)。3時間の固定後、5つの肺葉を分離し(目の直接観察下)、右肺の頭蓋葉、中葉、および副葉を別々に埋め込みます。 右肺の尾葉を肺葉-気管支接合部に垂直な方向に左から右へ4mmで2つに切り、切断面を上に向けてワックスブロックに埋め込む。 左肺葉に3つの切り込みを入れます。最初のカットは、メイン気管支接合部の横方向、上部から2mm下に行います。2番目のカットは、メイン気管支接合部の横方向、上部から5mm下に行います。ローブの端、上部から8mm下に3番目のカットを行います。ティッシュの最上部を捨て、残りの3つのピースをワックスブロックに包み、切断面を上に向けています。注:複数の肺片を一緒に埋め込む場合、顕微鏡拭き取り紙を使用してそれらを包み、組織包埋ボックスに入れて脱水プロセスを続行できます。 組織を固定剤に24時間再固定します。 ティッシュブロックを容器に入れ、流水で15分間すすぎます。 組織を次の溶液に順次置きます:65%エタノール30分間、75%エタノール30分間、85%エタノール30分間、95%エタノールIを60分間、95%エタノールIIを60分間、無水エタノールIを60分間、無水エタノールIIを60分間、70%エタノールを120分間、80%エタノールを120分間、 90%エタノールで120分、95%エタノールで120分、無水エタノールIで120分、無水エタノールIIで120分。 組織をキシレンIに30分間、キシレンIIに30分間置きます。 組織を54°C未満で1時間、硬質ワックスIを58°Cで1時間、硬質ワックスIIを58°Cで30分間静寂します。 適切な金型サイズを選択し、適切な量の液体パラフィンを充填し、鉗子を使用して、金型の中央にある埋め込みフレーム内の組織を正しい方向に配置します。型と組織を埋め込み機の凍結領域に置き、鉗子で組織をやさしく押します。 パラフィンがわずかに白くなり始めたら、覆われていない埋め込みフレームを金型の上にすばやく配置し、2回目のワックス注入を実行して、埋め込みフレームの下部にある穴を塞ぎます。金型全体を冷凍テーブルに移して成形します。 ワックスブロックをスライサーに固定し、粗いトリミングと細かいトリミングにより滑らかで平らな切断面を露出させた後、ミクロトームのホイールクランクを回転させて厚さ4μmのスライスを切断します。 取り外した部分を順番に水面にスムーズに配置します。セクションが完全に伸びたら、各セクション間の接合部で壊れたピースを分離します。 セクションの下にスライドガラスを傾け、接触したら、スライドを垂直にゆっくりと均等に水面から持ち上げます。セクションはスライドガラスに接着します。 2. 肺微小血管系検出のための免疫蛍光染色 パラフィン包埋スライスを65°Cのオーブンに60分間置きます。 スライスをスライドラックに置き、染色ジャーで次の手順を実行します:キシレン1、キシレン2、キシレン3をそれぞれ15分間浸漬し、続いてキシレン/エタノール(1:1)に5分間浸漬し、100%エタノール#1、100%エタノール#2、85%エタノール、75%エタノール、および蒸留水にそれぞれ5分間浸します。 修飾クエン酸ナトリウム抗原賦活化溶液を脱イオン水で50倍に希釈します。電子レンジを高出力で沸騰するまで予熱し、スライドを抗原抽出物に入れます。スライドを抗原抽出物中で15分間沸騰させた後、室温まで自然に冷却します。 スライドをPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。0.25%トリトンを2回、各10分間透過処理します。 免疫組織化学ペンで組織を囲み、室温(RT)で5%BSAと1時間インキュベートします。スライドをPBSで5分間一度洗浄します。 Alexa-647 Fluor標識IB4 およびDAPI染色を行います。IB4 を氷上に置き、1%BSAで1:50に希釈します。円の周りの余分な水分を取り除き、希釈したIB4 を各組織切片に50〜100 μL加え、4°Cで一晩インキュベートします(このステップ以降、すべての手順は暗所で行ってください)。 スライドをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。0.25% Triton で 10 分間透過処理します。 DAPI(10 μg/mL)をPBSで1:10の比率で希釈し、各組織切片に50〜100 μLを室温で5分間加えます。 スライドをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。 光の露出を避けて、色あせ防止封入剤をスライドに一滴塗布します。スライドを風乾し、蛍光顕微鏡で核と標的シグナルの画像を観察および取得します。 3. 肺微小血管密度の定量化 画像を取得します。若年層と高齢者の両方の各肺葉について、10倍の対物レンズの下で肺微小血管密度信号とDAPI信号を観察します。 観察結果に基づいて、各チャンネルの光源強度と露光時間を標準化します。各肺葉の全領域をカバーするデュアルチャネル画像をキャプチャします。画像を 2 つのチャネルを持つ ND2 形式で保存します (図 2)。 画像Jを用いて定量化します(補足図1)。ImageJソフトウェアを起動します。 指定された画像をImageJにインポートし、ロードして選択します。それに応じてチャネルを分割します。DAPIとIB2 の両方の4チャンネルのND4形式でファイルをロードします。 [分析]に移動し >スケールを設定し>画像パラメータを0.48μm/ピクセル( 写真パラメータによって異なります)に構成 >グローバル>OKに設定します。 同じ表示範囲を設定して、画像の表示効果を調整します。 [画像]を選択し>>明るさ/コントラスト>セットを調整します。2つのチャネルのそれぞれに個別に表示範囲を設定します、IB4:0-10000;DAPI:0-20000。 バックグラウンド信号の影響を排除するには、次の手順に進みます。 [Process] > [Math] > [Subtract] をクリックします。 背景のMagic Wand ツールによって検出された信号値に基づいて、背景信号を減算します、IB4:3000;DAPI:300です。 元の画像に最も一致するしきい値を選択するには、[ 画像] > [複製] に移動します。 元の画像と複製画像の両方を選択します > タイプ > 8 ビット。 肺の微小血管系を正確に識別するために、適切な閾値を選択します。画像をクリックして >>しきい値>インターモードを調整します(元の図に対して最も現実的なしきい値を選択します)、[ 暗い背景]>[適用]>チェックマークを付けます。 動脈や静脈を含むマウス肺の大きな血管からIB4 陽性シグナルを除去する: Magic Wand ツールを使用して、複製した画像と比較して大きな血管を選択し、[ 削除]をクリックします(大きな血管の内皮細胞のIB4 陽性シグナルが除去されるまで繰り返します)。注:IB4 染色シグナルは、マウス肺の動脈および静脈の内皮細胞で検出されます。肺微小血管系の発生を特異的に検査するためには、より大きな血管の内皮細胞のシグナル病巣を均一に除去することが推奨されます。 ターゲット信号の数をカウントし、[解析] > [測定値の設定] をクリックし、[エリア]、[しきい値に制限]、[ラベルを表示] にティックします。次に、[パーティクルの分析]を選択し、[サイズ]を0-無限大に設定します。真円度:0.00-1.00;表示する:過度にマスクします。[要約]にチェックマークを付けて、[OK]をクリックします。 [Summarize Results (結果の集計)] > [File (ファイル>名前を付けて保存)] を選択します。 データ分析と統計同じ画像で、IB4 陽性病巣と DAPI 陽性病巣の数をそれぞれ一致させ、統一されたテーブルに整理します。 示された若年層または年齢層の各葉の IB4 陽性病巣と DAPI 陽性病巣の総数を要約します。IB4陽性病巣の総数を各葉の DAPI 染色病巣の総数で異なるグループで割ることにより、IB4 陽性病巣の割合 (%) を計算します。図3Aに示すように、IB4陽性病巣の数、DAPI染色病巣の数、およびIB4陽性病巣の割合(%)を示します。 データ分析ソフトウェアを起動し、新しい列テーブルを作成します。注:ここでは、統計分析にGraphPad Prism 9を使用しました。 グループAからグループJまで順番に「若頭蓋葉」、「旧頭蓋葉」、「若中葉」、「旧中葉」、「若尾葉」、「旧尾葉」、「若副葉」、「旧副葉」、「若左葉」、「旧左葉」と名付けます。次いで、対応するIB4 陽性病巣(%)を表(補足表1)に入力する。 ペアワイズ比較に対応のないt検定を使用して、2つの年齢グループ間の対応する地域の有意差を評価します。5つのローブに対して合計5つの比較を行います。 結果を視覚化するためのグラフを作成します (図 3B)。棒グラフを選択し、図に統計分析を含めます。

Representative Results

主気管支の病変と小さな気道枝の病変を区別するには、これら 2 種類の気道の病変の連続構造が観察されていることを確認することが重要です。これは、 図1で概説した切断および埋め込みの手順に従って実現できます。マウスには多数の肺葉があり、さまざまな方向に向けられ、メッシュ状の構造を持っているため、他の固形組織と比較して?…

Discussion

肺微小血管密度の研究は、肺の生理学的プロセスの理解や呼吸器疾患のバイオマーカーの定義に重要な意味を持っています。肺循環は、内皮細胞の細い層に包まれた広範な毛細血管表面積を誇っています。これらの細胞と肺胞上皮細胞の調和のとれた並置は、ガス交換の複雑なプロセスを容易にするために特別に設計された壊れやすい肺胞毛細血管膜を生じさせます…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、West China School of Pharmacyの公開実験プラットフォームから受けた貴重な支援に感謝の意を表します。特に、病理学に関する重要で非常に価値のあるアドバイスを提供してくださったWendong Wang氏に感謝します。本研究は、四川省科学技術部からの助成(助成金2023NSFSC0130および2023NSFSC1992)と「中央大学基礎研究費」からTJへの資金提供を受けて実現しました。

Materials

4% Paraformaldehyde Biosharp BL539A Tissue Fixative
4',6-diamidino-2-phenylindole MCE HY-D0814 Nucleic Dyes
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4 Thermo I32450 Binding Microvessels
Anti-fluorescent Tablet Sealer Abcam AB104135 Sample Fixation
Antigen Repair Fluid Biosharp BL151A Repair of Antigenic Sites
Biopsy Cassette ActivFlo 39LC-500-1 Fixing and Positioning Tissue Samples
Bovine Serum Albumin Sigma B2064-50G Sealing Solution
Cold Plate Leica HistoCore Arcadia H  Freezing Samples
Constant Temperature Electric Drying Oven Taisite 101-0AB High Temperature Repair
Disposable Microtome Blade Leica 14035838383 Cutting Tissue Samples to Prepare Sections
Embedding Molds Shitai 26155166627 Fixing Tissue Samples
Ethanol Kelong CAS 64-17-5 Tissue Dehydration Solution
Heated Paraffin Embedding Station Leica EG1150 Embedding Tssue Samples in Paraffin
HistoCore Water Bath Leica HI1220 Flatten and Fix Tissue Samples
ImageJ (Fiji)  NIH 1.54f Quantitative Tool
Immunohistochemistry Pens Biosharp BC004 Water-blocking Agent
Medical Forceps Shanghai Medical Equipment N/A Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples
Microscope Nikon Ts2 Imaging Device
Mounting Media Jiangyuan Tasteless Fixing and Preserving Tissue Sections
Paraffin Wax SCHLEDEN 80200-0014 Fixing Tissue Structure
PBS Beyotime C0221A Wash Buffer
Pentobarbital Sodium Beijing Chemical Reagent Company Q/H82-F158-2002 Anesthetic
Rotary Microtome Biobase Bk-2258 Preparing Slices
Sterile Scissors Shanghai Medical Equipment N/A segmenting Tissue Samples
Surgical Scalpel Shanghai Medical Equipment N/A Cutting Tissue Samples
Triton  Solarbio T8200 Permeabilization Solution
Wash-Free Slide PLATINUM PRO PRO-04 Fixing Samples for Staining
Xylene SUM XK13-011-00031 Tissue De-waxing Solution

参考文献

  1. Jia, T., et al. Fgf-2 promotes angiogenesis through a srsf1/srsf3/srpk1-dependent axis that controls vegfr1 splicing in endothelial cells. BMC Biol. 19 (1), 173 (2021).
  2. Schneider, J. L., et al. The aging lung: Physiology, disease, and immunity. Cell. 184 (8), 1990-2019 (2021).
  3. Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).
  4. Lipskaia, L., et al. Induction of telomerase in p21-positive cells counteracts capillaries rarefaction in aging mice lung. bioRxiv. , (2022).
  5. Hoshino, M., Takahashi, M., Aoike, N. Expression of vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, and angiogenin immunoreactivity in asthmatic airways and its relationship to angiogenesis. J Allergy Clin Immunol. 107 (2), 295-301 (2001).
  6. Ackermann, M., et al. Pulmonary vascular endothelialitis, thrombosis, and angiogenesis in covid-19. New Engl J Med. 383 (2), 120-128 (2020).
  7. Wertheim, B. M., et al. Isolating pulmonary microvascular endothelial cells ex vivo: Implications for pulmonary arterial hypertension, and a caution on the use of commercial biomaterials. PLoS One. 14 (2), e0211909 (2019).
  8. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. (168), e62215 (2021).
  9. Ramasamy, S. K., Kusumbe, A. P., Adams, R. H. Regulation of tissue morphogenesis by endothelial cell-derived signals. Trends Cell Biol. 25 (3), 148-157 (2015).
  10. Amersfoort, J., Eelen, G., Carmeliet, P. Immunomodulation by endothelial cells – partnering up with the immune system. Nat Rev Immunol. 22 (9), 576-588 (2022).
  11. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072 (2020).
  12. Corliss, B. A., Mathews, C., Doty, R., Rohde, G., Peirce, S. M. Methods to label, image, and analyze the complex structural architectures of microvascular networks. Microcirculation. 26 (5), e12520 (2019).
  13. Phillips, M. R., et al. A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography. J Surg Res. 207, 115-122 (2017).
  14. Chadwick, E. A., et al. Vessel network extraction and analysis of mouse pulmonary vasculature via x-ray micro-computed tomographic imaging. PLoS Comput Biol. 17 (4), e1008930 (2021).

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記事を引用
Li, C., Wang, Z., Du, J., Jia, T. Quantifying Pulmonary Microvascular Density in Mice Across Lobules. J. Vis. Exp. (215), e66681, doi:10.3791/66681 (2025).

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