ここでは、イソレクチンB4の単一染色を使用して、マウス全体の肺組織の肺微小血管密度の偏りのない定量を行うためのシンプルで経済的なプロトコルについて説明します。
肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害に関連しており、血管壁の完全性、血流調節、およびガス交換に深く関連しています。マウスモデルでは、肺葉のサイズ、形状、位置、血管新生に大きな違いが見られますが、既存の方法では微小血管密度を定量化する際のこれらの変動が考慮されていません。この制限は、肺の微小血管機能障害の包括的な研究と、さまざまな小葉にわたる微小血管系循環の潜在的なリモデリングを妨げます。私たちのプロトコルは、マウスの異なる葉にわたる気道枝のサイズ、形状、および分布を活用して、肺微小血管密度の変化を定量化するために 2 つの切片化方法を採用することにより、このギャップに対処します。次に、イソレクチンB4 (IB4)染色を利用して、さまざまなスライス上の肺微小血管内皮細胞を標識し、その後、無料で入手できるソフトウェアImageJを使用して偏りのない微小血管密度分析を行います。ここで紹介した結果は、若齢マウスと老齢マウスを比較して、老化に伴う肺小葉全体の微小血管密度の変化の程度が異なることを強調しています。このプロトコルは、肺微小血管密度の偏りのない定量化のための簡単で費用対効果の高いアプローチを提供し、肺微小血管系の生理学的側面と病理学的側面の両方に関する研究を促進します。
内皮細胞(EC)は、血管の内層に位置する特殊なタイプの細胞で、動脈と静脈の樹全体を覆い、血管と臓器の安定性を維持する上で重要な役割を果たしています1。肺は高度に血管新生された器官であり、血管壁の形成、血流の調節、ガス交換の促進、炎症反応の調節、血小板活性の制御、血管の成長に関与する調節物質の分泌、修復、凝固バランスの維持など、肺で重要な生理学的および病理学的役割を果たします。
肺微小血管内皮細胞(LMEC)は、肺組織、特に肺の微小血管系(毛細血管)にある特定の内皮細胞であり、肺のより一般化された動脈および静脈内皮細胞と区別されます。これらの細胞は、血管緊張の調節、血管透過性の制御、炎症反応の調節への参加、血栓形成の調節など、さまざまな機能を持っています。それらは、肺循環、ガス交換、栄養素の輸送の調節に重要な役割を果たし、肺に関連するさまざまな生理学的および病理学的プロセスに関与しています。また、肺血管新生の異常な交代は、肺の微小血管機能障害と関連しています3。Larissa L.らは、従来の内皮細胞マーカーCD31と空間的局在化(具体的には肺の末梢領域)を用いて、老齢マウス(18ヶ月齢)の微小血管内皮細胞密度が若齢マウス(4ヶ月齢)と比較して有意に減少していることを観察しました4。喘息に関連する肺の病理の文脈では、Makoto H. et al. は、喘息患者からの抗コラーゲン IV で染色された気管支生検標本の血管誘導の大幅な増加を、対照被験者と比較して示しました5.最近、透過型顕微鏡と走査型電子顕微鏡の技術を導入することにより、Maximilian A. et al. は、Covid-19 または Influenza A (H1N1) で死亡した患者における腸感受性および発芽血管新生に関連する特徴の数値密度が著しく増加したことを報告しました6。明らかに、異常な微小血管の起源は肺の機能障害と関連しています。しかし、現在、微小血管密度の変化を定量化するための簡単で経済的な方法はありません。
マウスモデルでは、肺は従来、右頭蓋、右中央、右尾、左頭蓋、左尾の5つの異なる葉に分割されます。各葉は、サイズ、形状、位置、および血管新生の可能性に関して独自の特性を示し、効率的なガス交換と肺循環の潜在的に相乗的な調節に貢献します。しかし、私たちの知る限りでは、肺微小血管の変化を調査する際に、これらの肺葉の違いを説明する方法論はありません。
この研究は、肺微小血管密度の偏りのない定量的評価のために、肺微小内皮細胞7の明確なマーカーであるIB4を利用して、マウスで小葉を切片化する新しい方法を提示します。この革新的なアプローチは、マウスの個々の葉の明確な特性を考慮することにより、マウスの肺の微小血管の変化をより包括的に理解する必要性に対処します。デモンストレーションとして、老化マウスでは、肺の大幅な減少
微小血管密度は、尾葉と左葉の両方で特異的に観察されます。このプロトコルは、マウス肺の微小血管状況の変化の調査に葉特異的解析を統合することの重要性を強調しています。特に、この方法は、血管新生を超えて、肺の発達と病変の生理学的および病理学的進行の両方を包括的に理解しようとする研究者にとって貴重な研究参考文献を提供します。
肺微小血管密度の研究は、肺の生理学的プロセスの理解や呼吸器疾患のバイオマーカーの定義に重要な意味を持っています。肺循環は、内皮細胞の細い層に包まれた広範な毛細血管表面積を誇っています。これらの細胞と肺胞上皮細胞の調和のとれた並置は、ガス交換の複雑なプロセスを容易にするために特別に設計された壊れやすい肺胞毛細血管膜を生じさせます…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、West China School of Pharmacyの公開実験プラットフォームから受けた貴重な支援に感謝の意を表します。特に、病理学に関する重要で非常に価値のあるアドバイスを提供してくださったWendong Wang氏に感謝します。本研究は、四川省科学技術部からの助成(助成金2023NSFSC0130および2023NSFSC1992)と「中央大学基礎研究費」からTJへの資金提供を受けて実現しました。
4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | Tissue Fixative |
4',6-diamidino-2-phenylindole | MCE | HY-D0814 | Nucleic Dyes |
Alexa-647 Fluor Conjugated Isolectin B4 | Thermo | I32450 | Binding Microvessels |
Anti-fluorescent Tablet Sealer | Abcam | AB104135 | Sample Fixation |
Antigen Repair Fluid | Biosharp | BL151A | Repair of Antigenic Sites |
Biopsy Cassette | ActivFlo | 39LC-500-1 | Fixing and Positioning Tissue Samples |
Bovine Serum Albumin | Sigma | B2064-50G | Sealing Solution |
Cold Plate | Leica | HistoCore Arcadia H | Freezing Samples |
Constant Temperature Electric Drying Oven | Taisite | 101-0AB | High Temperature Repair |
Disposable Microtome Blade | Leica | 14035838383 | Cutting Tissue Samples to Prepare Sections |
Embedding Molds | Shitai | 26155166627 | Fixing Tissue Samples |
Ethanol | Kelong | CAS 64-17-5 | Tissue Dehydration Solution |
Heated Paraffin Embedding Station | Leica | EG1150 | Embedding Tssue Samples in Paraffin |
HistoCore Water Bath | Leica | HI1220 | Flatten and Fix Tissue Samples |
ImageJ (Fiji) | NIH | 1.54f | Quantitative Tool |
Immunohistochemistry Pens | Biosharp | BC004 | Water-blocking Agent |
Medical Forceps | Shanghai Medical Equipment | N/A | Grasping, Manipulating, or Moving tissue samples |
Microscope | Nikon | Ts2 | Imaging Device |
Mounting Media | Jiangyuan | Tasteless | Fixing and Preserving Tissue Sections |
Paraffin Wax | SCHLEDEN | 80200-0014 | Fixing Tissue Structure |
PBS | Beyotime | C0221A | Wash Buffer |
Pentobarbital Sodium | Beijing Chemical Reagent Company | Q/H82-F158-2002 | Anesthetic |
Rotary Microtome | Biobase | Bk-2258 | Preparing Slices |
Sterile Scissors | Shanghai Medical Equipment | N/A | segmenting Tissue Samples |
Surgical Scalpel | Shanghai Medical Equipment | N/A | Cutting Tissue Samples |
Triton | Solarbio | T8200 | Permeabilization Solution |
Wash-Free Slide | PLATINUM PRO | PRO-04 | Fixing Samples for Staining |
Xylene | SUM | XK13-011-00031 | Tissue De-waxing Solution |