概要

患者由来腫瘍オルガノイドの細胞放射線感受性を定量化するためのライブイメージング

Published: April 05, 2024
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概要

ここでは、患者由来の腫瘍オルガノイドの電離放射線に対する感度を定量化するための簡単なライブイメージングアプローチについて詳しく説明します。

Abstract

放射線療法(RT)は、現代の臨床がん管理の主力の1つです。しかし、すべての種類のがんが放射線に対して等しく感受性があるわけではなく、多くの場合(常にではありませんが)、電離光線によって誘発される悪性細胞の酸化的DNA損傷を修復する能力の違いによるものです。クローノジェニックアッセイは、培養がん細胞の電離照射に対する感受性を評価するために何十年にもわたって採用されてきましたが、これは主に、照射されたがん細胞が遅延して死滅することが多く、短期のフローサイトメトリーまたは顕微鏡法による定量化が困難なためです。残念ながら、クローノジェニックアッセイは、患者由来腫瘍オルガノイド(PDTO)などのより複雑な腫瘍モデルには使用できません。実際、確立されたPDTOを放射線で照射しても、その幹様コンパートメントが完全に根絶されない限り、必ずしも多細胞単位としての成長が阻害されるわけではありません。さらに、PDTO由来の単一細胞懸濁液を照射すると、確立されたPDTOの状況で悪性細胞のRTに対する感受性を適切に再現できない場合があります。ここでは、確立されたPDTOを電離放射線に曝露し、その後、単一細胞解離、適切な培養条件での再プレーティング、およびライブイメージングを含む従来のクローン生成アッセイの適応について詳しく説明します。非照射(制御)PDTO由来幹様細胞は、PDTO特異的な効率で増殖するPDTOを改質しますが、これは線量依存的に照射によって悪影響を受けます。これらの条件では、制御PDTOが所定のスペース占有率を達成するまで収集されたタイムラプス画像の放射線感受性の尺度として、PDTO形成効率と成長率を定量化できます。

Introduction

外照射療法(RT)は、一般的に管理可能な副作用の明確なスペクトル1に関連する顕著な抗がん活性だけでなく、非常に広範な臨床利用可能性も反映しており、現代の腫瘍学の主力の1つです(先進国のほとんどのがんセンターには、外部ビームRT用の最新の線形加速器が装備されています)2.この考えに沿って、RTは、一般的には早期疾患の文脈における治癒目的3,4と、転移性腫瘍5からの症状(例えば、痛み)を封じ込めるための緩和的応用の両方において、世界的に成功裏に採用されている。とは言うものの、すべての悪性腫瘍がRTに対して等しく感受性があるわけではなく、これは多くのがん細胞内因性および微小環境の特徴を反映しています6,7,8,9。独立した例として、DNA修復および酸化還元恒常性に影響を与える様々ながん関連遺伝的およびエピジェネティックな変化は、内因性放射線感受性の増加または減少と関連しており、これは主に、DNAおよび他の高分子10,11,12,13に直接活性酸素種(ROS)依存性の損傷を引き起こすことにより、がん細胞を殺傷するRTの能力を反映している。

過去数十年にわたり、培養ヒトおよびマウスのがん細胞14,15,16の放射線感受性を評価するために、クローン生成アッセイが日常的に使用されてきた。実際、化学療法やその他のストレッサーは、悪性細胞をかなり迅速に殺すことが多いが、臨床的に適切な用量で用いられるRTは、細胞死の遅延型を最も頻繁に引き起こすが、これは、細胞傷害性刺激への曝露から24-72時間後に(死細胞を選択的に染色する)重要な色素の細胞取り込みを測定するなど、短期のフローサイトメトリーまたは顕微鏡法支援技術では単純に定量化できない17.クローノジェニックアッセイは、単純でかなり安価な試薬に頼るだけでなく、RT用量反応の定量分析のためのかなり単純な数学的ツールである、いわゆる「線形二次」モデルの実装を可能にするため、特に便利でした18,19同様に、培養がん細胞(確立された細胞株および初代患者由来細胞を含む)は、がん生物学のさまざまな側面を試験するための便利なプラットフォームを提供してきた、これには、治療に対する感受性がかなり単純化されている(ただし、これらに限定されない)が、1つの大きな制限は、構造化された腫瘍微小環境(TME)の欠如である2021.実際、二次元がん細胞培養は、細胞間コミュニケーションや細胞外マトリックスとの相互作用を本質的に再現することができず、がんで発生する22,23。患者由来腫瘍オルガノイド(PDTO)は、少なくとも部分的にそのような制限を回避する腫瘍モデルとして登場している24,25,26。

残念ながら、従来のクローン生成アッセイは、PDTOの放射線感受性を評価するために使用することはできません。一方では、確立されたPDTOを照射しても、PDTOの形成と成熟に関与するが、より分化したPDTO構成細胞と比較してDNA損傷に対する耐性が高い27という幹様コンパートメントが完全に根絶されない限り、多細胞ユニットとしての成長を必ずしも損なうとは限りません。一方、PDTO由来の単一細胞懸濁液を照射すると、形成されたPDTOの状況で示されるPDTO構成細胞(幹様細胞を含む)の放射線感受性が適切に再現されない可能性があります。ここでは、乳がんのPDTOのライブイメージングを利用して、以前に電離放射線に曝露されたPDTO由来細胞のPDTO形成効果と増殖速度を、非照射細胞と比較して監視する技術について詳しく説明します。必要なバリエーションは、主に個々のPDTOの異なる生物学(例えば、培養培地の必要量、成長率)を反映しており、このプロトコルは、乳腺起源と非乳腺起源の両方のPTDOの幅広いパネルでの放射線感受性の研究に適していると期待しています。

Protocol

この試験で使用された試薬および機器は、 材料表に記載されています。 1. オルガノイド培養 注: TNBC#1 PDTO は、トリプルネガティブ乳がん (TNBC) の患者から外科的に切除された腫瘍組織に基づいて、バイオバンキング プロトコル (IRB21-06023682) に参加するためのインフォームド コンセントを提供したこ?…

Representative Results

TNBC#1 PDTOは、0日目に0(未照射対照)、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、または10 Gyの単回放射線量に被曝した。その直後、PDTOを解離して、各実験条件のシングルセル懸濁液を得ました。次に、PDTO由来の細胞を、ウェルの中央に堆積した66%マトリゲルドーム(各50μL)内の48ウェルプレートに、条件ごとに3回のテクニカルレプリケートで播種しました。プレートをライブイメージングシ…

Discussion

ここでは、乳がんのPDTOとライブイメージングを利用して、(1)in vitroでのPDTO照射によるPTDO形成幹様細胞の持続性、および(2)これらの細胞が生成する(可能性のある)PDTOの増殖速度に基づいてPDTO放射線感受性を定量化する従来のクローン生成アッセイの適応について説明します。このプロトコルの重要なステップには、(1)良好な生存率を可能にするドーム占有への…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロトコルの開発に協力してくれたRaymond Briones氏とWen H. Shen氏(Weill Cornell Medical College、New York、NY、USA)に感謝します。この研究は、米国国防総省BCRP(#W81XWH2120034、PI:Formenti)からのTransformative Breast Cancer Consortium Grantによってサポートされています。

Materials

40 µm mesh filter Thomas Scientific 1164H35
B27 Invitrogen 17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter Nexcelom
DMEM F/12 Corning  12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF Peprotech AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope  Thermo Fisher Scientific 12-563-460
FGF10 Peprotech 100-26
FGF7 Peprotech  100-19
GlutaMax Invitrogen  35050061
Hepes Invitrogen  15630-080
IncuCyte software 2021A Sartorius version: 2021A
Incucyte SX1 Sartorius model SX1
Incucyte validated 48 well plate Corning  3548
Matrigel Discovery Labware 354230
nAc Sigma Aldrich  A9165-5G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Noggin Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate Cellstar 657 185
NR (Heregulin) Peprotech 100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190 Sigma Aldrich  S7067
PBS Corning  21-040-CV
PenStrep Invitrogen 15140-122
Primocin Invivogen ant-pm-1
Rspondin Media Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)  Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01 Tocris 2939
Trypan blue Stain (0.4%) Gibco 15250-61
TrypLE Gibco 112605-028
Y-27632 (RhoKi) Selleck S1049

参考文献

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記事を引用
Charpentier, M., Bloy, N., Formenti, S. C., Galluzzi, L., Demaria, S. Live Imaging to Quantify Cellular Radiosensitivity in Patient-Derived Tumor Organoids. J. Vis. Exp. (206), e66680, doi:10.3791/66680 (2024).

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