私たちは、Vessels-on-a-Plate(VOP)と呼ばれる3Dバイオプリンティング技術を使用して、標準的な6ウェルプレート上で柔軟なサイズと目的のパターンを持つ血管チャネルのハイスループット生産のためのプロトコルを提示します。このプラットフォームは、内皮の障害に関連する疾患の治療法の開発を進める可能性を秘めています。
血管透過性は、冠動脈の内皮機能障害や血液脳関門の機能障害など、内皮の障害に関連する疾患の治療法を開発する上で重要な要素です。既存の製造技術では、人体の血管網の幾何学的変化を適切に再現しておらず、これが疾患の進行に大きく影響します。さらに、これらの手法には、薬理学的試験に必要なハイスループット生産を妨げる多段階の製造プロセスが含まれることがよくあります。この論文では、標準的な6ウェルプレート上で直接、目的のパターンとサイズの複数の血管組織を作成するためのバイオプリンティングプロトコルを提示し、バイオプリンティング技術における既存の分解能と生産性の課題を克服します。ハイドロゲル内に6つの中空の灌流チャネルを構築するための簡略化された製造アプローチが確立され、その後、ヒトの臍帯静脈内皮細胞で裏打ちされて、機能的で成熟した内皮が形成されました。3Dバイオプリンティングのコンピュータ制御の性質により、高い再現性が保証され、従来の方法よりも手作業による製造ステップが少なくて済みます。これは、血管透過性をモデル化し、創薬を前進させるための効率的なハイスループットプラットフォームとしてのVOPの可能性を浮き彫りにしています。
人体全体の血管ネットワークは、血液と周囲の組織との間の分子や細胞の交換を動的に制御することにより、重要な輸送障壁として機能します。この調節は、組織の浮腫を予防し、選択的な栄養素と細胞の交換を可能にするために不可欠であり、したがって組織の代謝と恒常性をサポートします1。多くの健康状態の要因である内皮透過性の変化は、疾患の重症度と治療効果の両方に影響を与えます2。血管内皮は選択的なバリアとして機能し、血管、組織、臓器間の移動を促進します。この調節には、溶質や低分子の基本的なろ過、血管関門の意図的な破壊、プロスタグランジンや成長因子などの分子の透過性レベルへの影響など、いくつかのメカニズムが関与しています3。
この調節の主な要因には、内皮細胞の結合、白血球の遊走、および血液脳関門の機能が含まれます4。その複雑さを考えると、プロセスはさまざまな環境によって異なり、さまざまな血管タイプが関与し、異なる解剖学的経路を利用します。血管透過性の生物学的基盤を理解することは、異常な血管透過性に関連する状態を治療するための治療アプローチを考案するために重要です。血管透過性を維持することは、血管系と周辺組織の健康にとって非常に重要です。その結果、この機能の障害は内皮機能障害、つまり内皮が正常な機能を失う状態につながります。
内皮機能障害は、高血圧、冠動脈疾患、糖尿病、癌など、いくつかの一般的なヒト疾患の前兆です5,6,7。この状態は、血管拡張の減少、血管透過性の増加、炎症誘発性状態への傾向など、いくつかの方法で現れる可能性があります。この病理学的状態は、冠状動脈疾患、脳卒中、末梢動脈疾患8など、いくつかの重大な心血管疾患の最も初期の段階であり、これらは引き続き米国における主要な死亡原因1である。内皮機能障害は、血液脳関門(BBB)だけでなく、心血管の健康にも影響を及ぼし、さまざまな神経疾患の進行に大きな役割を果たしています。機能障害はBBBの透過性を増加させ、毒素、病原体、免疫細胞が中枢神経系に侵入することを可能にし、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、脳感染症などの神経障害の一因となります9。
糖尿病における内皮機能障害は、内皮が血管緊張を調節し、一酸化窒素などの血管拡張メディエーターを産生する能力が損なわれることを特徴とし、血管拡張の障害につながります10。この状態は、プロテインキナーゼCの活性化や酸化ストレスなどの高血糖誘発経路によって悪化し、糖尿病性血管疾患の進行に大きく寄与します11。さらに、炎症環境は腫瘍細胞の脳微小血管内皮細胞への接着を促進することがわかっていますが、漏出性内皮は癌転移の主要な要因であると報告されています12,13。血管の形状は、脳腫瘍の転移に直接影響を与えることがわかっています。腫瘍細胞は、血管の湾曲が大きい領域に優先的に付着します7。この知見は、がん転移における血管形状の重要性を強調している。さらに重要なことに、線維症や癌などの状態では、内皮バリア機能の破壊が疾患の発症に関与するだけでなく、適切な薬物送達を妨げることにより治療効果も妨げます14。血管透過性に関する研究は、心血管疾患の治療を進歩させ、血管機能の低下を伴う他の疾患の管理に関する洞察を提供するために重要です。
血管透過性が健康と疾患に重要な役割を果たすことを考えると、従来の2Dおよび3Dのin vitro試験プラットフォームと並行して、動物モデルを使用して治療開発のための内皮バリアの選択的な性質を調べることに多くの研究が焦点を当ててきました。ただし、動物モデルには、種固有の違いと倫理的問題、および高コストのために制限があります15,16。例えば、ファイザーは2004年に、過去10年間で、動物モデルで有望な効果を示した医薬品開発に20億ドル以上を費やしたが、最終的には高度なヒト試験ステージ17で失敗したと述べました。さらに、従来の2Dモデルは、3次元(3D)アーキテクチャや血管チャネルの複雑な幾何学的構造を正確に模倣していません。
バイオファブリケーション技術の進歩に伴い、3Dアーキテクチャを再現しながら血管チャネルを作製する取り組みが盛んに行われています。マイクロスケールの血管チャネルは、ソフトリソグラフィーを使用してマイクロ流体チップ内で効果的に作製できるため、リアルタイム分析の利点を提供します18,19。ヒドロゲル鋳造または細胞シートを型またはマンドレルの周りに巻き付けるなどの代替方法を使用して、所望の直径20,21を有する自立した管状構造を作成することができる。ただし、これらの方法には制限があります。例えば、マイクロ流体チップはマイクロチャネル構成に制限されており、金型の周りのハイドロゲル鋳造では、複数の形状を効果的に再現することはできません。
3Dバイオプリンティング技術の出現により22、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)ベースのハイドロゲル材料23,24を正確に堆積することにより、複雑な形状を複製することが可能になりました。同心円状に配置されたノズルを使用する方法、例えば、同軸および三軸25,26を使用する方法など、一部のバイオプリンティング方法では、二股チューブを作成できません。しかし、複雑な構造は、犠牲的なパターニング法27で達成することができる。これらのバイオプリンティング法はいずれも、創薬における薬理学的研究の重要な要件であるハイスループットのin vitroモデリングを可能にすることが実証されていません。ここでは、内皮化された血管チャネルを効率的に作製し、寸法を効率的に制御する方法を提示する。
私たちは、市販の6ウェルプレートと、バイオプリンターがECMハイドロゲル内で目的のサイズとパターンの血管チャネルを作製する犠牲的パターニング法を組み合わせて、簡単なアプローチを確立しました。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を播種して、これらのチャネルを内皮化し、透過性アッセイを通じて内皮の機能を評価しました。この設計では、チャネルの両側にメディアリザーバーを作成することでポンプレス灌流が可能になり、一般的に使用される2Dロッカーの助けを借りて重力駆動の流れを使用して動的培養を模倣します。このアプローチにより、チューブポンプが不要になり、ハイスループットアプリケーション向けのこのプラットフォームのスケーラビリティが容易になります。また、3Dバイオプリンティング技術のコンピュータ制御の性質により、製造プロセスが合理化され、製造中のエラーの可能性が減少します。VOPモデルは、創薬における薬理学的試験のための貴重なツールとして有望視されています。
3Dバイオプリンティング技術の精度、自動化、およびコンピューター制御の性質を利用して、市販のマイクロプレートリーダーや顕微鏡イメージングセットアップとの互換性を考慮して、標準的な6ウェルプレートで血管チャネルを作製するための合理化された方法を確立しました。プレートのデザインは、マルチサイズのチャンネルと、より大きなチャンネルの成長…
The authors have nothing to disclose.
本研究は、韓国政府(科学情報通信部、三井海洋科学技術庁)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けたものです。NRF-2019R1C1C1009606;番号2020R1A5A8018367;そして No.RS-2024-00423107]。本研究は、MSITが資金提供するNRF助成金のBio and Medical Technology Development Programの支援を受けたものである。NRF-2022M3A9E4017151 および No.NRF-2022M3A9E4082654]。この研究は、産業通商資源部(MOTIE、韓国)の資金提供を受けた技術革新プログラム[第20015148号]と錬金術師プロジェクト[第20012378号]の支援を受けました。この作業は、韓国農林業技術計画評価院(IPET)の支援も受け、農業・食糧・農村地域部(MAFRA)の資金提供を受けた「研究人材開発のための農業・食品融合技術プログラム」を通じて行われました。RS-2024-00397026]。
10 mL Serological Pipette | SPL | SPL 91010 | |
10 mL syringe | Shinchang Medical | ||
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
3D Bioprinter | T&R Biofab | 3DX-Printer | |
6-well plate | SPL | 37206 | |
Biological Safety Cabinets | CHC LAB | PCHC-777A2-04, | |
Brightfield Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
Cell Counting Kit (CCK8) | GlpBio | GK10001 | |
Cell Counting Kit (CCK8) | GlpBio | GK10001 | |
Cell Culture Flask 75T | SPL | 70075 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354230 | |
Distilled water | |||
DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
DMSO, Cell Culture Grade | Sigma aldrich | D2438 | |
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit | DOW | DC-184 | |
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit | DOW | 2924404 | |
D-PBS – 1x | Welgene | LB001-01 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use) | Promocell | C-22022 | |
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10) | eppendorf | ||
Ethyl Alcohol 99.9% | Duksan | D5 | |
Excel | Microsoft | ||
Fibrinogen from bovine plasma | Sigma Aldrich | F8630-1G | |
FITC Dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | |
Fluorescent beads (1.0 μm, green) | Sigma Aldrich | L1030-1ML | |
GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g | 3D Materials | 20JT29 | |
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL | Gibco | ||
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells) | Promocell | ||
ImageJ software | NIH | ||
Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator | |
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells) | Thermo Fisher | L3224 | |
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder | Tokoyo Chemical Industry CO. | 85073-19-4 | |
Marienfeld Superior, Counting chamber cover | Marienfeld Superior | ||
Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber | Marienfeld Superior | HSU-0650030 | |
Microcentrifuge | eppendorf | Centrifuge 5920 R | |
NCViewer.com | |||
Nitrogen tank | WORTHINGTON INDUSTRIES | LS750 | |
Omnicure UV Laser | EXCELITAS | SERIES 1500 | |
Parafilm M | amcor | PM-996 | |
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | |
Planetary Mixer | THINKY CORPORATION, japan | ARE-310 | |
Plasma treatment machine | FEMTO SCIENCE | CUTE-1MPR | |
Pluronic F-127 | Sigma aldrich | P2443-250G | |
Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS | Biosesang | PR4007-100-00 | |
Reagent storage cabinet | ZIO FILTER TECH | SC2-30F-1306D1-BC | |
Real time Live cell Imaging Microscope | Carl ZEISS | ||
Refrigerator | SAMSUNG | RT50K6035SL | |
ROCKER 2D digital | IKA | 4003000 | |
Scoop-Spatula | CacheBy | SL-SCO7001-EA | |
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25% | Sigma aldrich | T4049-100ML | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher scientific | 151-21-3 | |
Syringe Barrel Tip Cap | FISNAR | 3051806 | |
Tally counter | Control Company | C23-147-050 | |
Tapered Nozzle (18 G) | Mushashi | TPND-18G-U | |
Tapered Nozzle (22 G) | Mushashi | TPND-22G-U | |
Tapered nozzle 20 G | Musashi | TPND-20G-U | |
Thrombin from bovine plasma | Sigma Aldrich | T7326-1KU | |
Timer, 4-channel | ETL | SL.Tim3005 | |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15250061 | |
Trypsin Neutralizing Solution | Promocell | C-41120 | |
UG 24 mL UG ointment jar | Yamayu | No. 3-53 | |
UG 58 mL UG ointment jar | Yamayu | No. 3-55 | |
Water Bath | DAIHAN Scientific | WB-11 | |
Weight machine | Sartorius | bce2241-1skr |