概要

マウスの腸内微生物代謝物を評価するための下大静脈からの逐次採血とそれに続く門脈

Published: June 21, 2024
doi:

概要

このプロトコルは、マウスから門脈と下大静脈から血液を順番に採取して、腸内微生物代謝産物の産生と吸収を評価する方法を示しています。

Abstract

腸内微生物産物は、腸内で局所的に作用するだけでなく、循環に吸収されることが知られており、その影響は多数の遠隔臓器系にまで及ぶ可能性があります。短鎖脂肪酸(SCFA)は、難消化性食物繊維の発酵中に腸内細菌によって生成される代謝産物の一種です。彼らは現在、腸内細菌叢が宿主全体の腸-肺、腸-脳、およびその他の腸-臓器軸を介して腸外臓器系にどのように影響するかに重要な貢献者として認識されています。SCFAは結腸から腸組織を介して門脈(PV)に吸収されます。その後、肝臓を通過し、脳、筋肉、脂肪組織、肺などのさまざまな臓器で消費されます。SCFAは、排出された糞便物質で最も簡単に測定されますが、結腸内の糞便内容物からより正確な測定値が得られています。ここでは、マウスのSCFAの吸収、輸送、および全身レベルの研究には、単一の被験者のPVおよび全身循環血漿のサンプリングが好ましい可能性があることを提案する。PVおよび下大静脈(IVC)からの効率的な採血のための新しい技術を提示します 門脈および体循環からの比較的大量の血液の収集を可能にします。これは、PVをライゲーションすることによって達成され、それによってPVがそれに流れ込む腸間膜静脈から埋め戻されるときにPVの拡張または拡大を可能にします。この方法により、採血成功率と総採血量(IVCから最大0.3mL、PVから最大0.5mL)を向上させることができました。

Introduction

短鎖脂肪酸(SCFA)は、腸内細菌叢によって産生される代謝産物の主要なクラスです。腸内細菌叢と他の遠隔臓器との相互作用におけるそれらの重要な役割1は、それらが炎症を調節し、専用の受容体を介してシグナルを送り、細胞代謝基質として機能する方法を説明する研究によって裏付けられています2,3,4,5。私たちのグループの最近の研究では、SCFAが腸-肺軸6,7を介してin vivoで肺免疫緊張の重要なin vivo炎症調節因子であることが提案されています。追加の報告では、腸-脳軸8,9を介した代謝に対するそれらの機能的影響が説明されています。全体として、SCFAが宿主の生理学と病理学に及ぼす影響は、幅広い疾患プロセスにまたがる多数の研究グループによって積極的かつ集中的に調査されています。

酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、および酪酸(C4)は主要なSCFAであり、盲腸および大腸で摂取可能な食物繊維の発酵を通じて腸内細菌叢によって生成されます。3つのSCFAはすべて食事から直接摂取することもでき、哺乳類の細胞によってもアセテートのみが産生される可能性があります。SCFAは結腸に吸収され、腸上皮細胞によって部分的に利用されます(エネルギー源として、局所組織の免疫調節および腸バリアの維持をサポートします)。それらはまた、腸間膜静脈系10を介して門脈に運ばれる。酪酸は主に腸上皮で消費され、プロピオン酸は肝臓で消費され11,12、酢酸は末梢循環に入った後に筋肉や脂肪組織に作用することが報告されています13,14

SCFAの産生、吸収、および機能活性を包括的に評価するには、結腸内腔内、門脈循環、および末梢血中のSCFAレベルの知識が必要です。これは、門脈(PV)からの採血と、同じ動物内での全身循環を同時に、または連続的に行うことで達成できます。SCFAは揮発性であるため15、排出された糞便ペレット中のSCFAのレベルを測定することは、結腸内のレベルを正確に反映していない可能性があります。さらに、結腸内容物からの測定と比較して、PVに存在するSCFAのレベルは、宿主によって吸収された定常状態レベルと腸内細菌叢によって生成される不均一なレベルとの正味の合計をより正確に反映している可能性があります11。したがって、これらのPV SCFAレベルは、腸内の局所的な影響を超えて、宿主の生理学および病理に対するSCFAの影響を研究するためにより関連性があり、適切である可能性があります。

PVと全身循環血液の協調的かつほぼ同時に収集を行うには、正常な血液循環を維持し、自発呼吸をサポートするために、横隔膜を無傷のままにしておく必要があります。したがって、下大静脈(IVC)は、PV血液を採取しながら体循環血液を得るのに理想的な部位です。このIVC血液は、全身性炎症を評価するための循環サイトカインの測定など、他の目的にも使用できます。

現在、体循環とPVの両方から血液を採取する方法は、より大きなげっ歯類で報告されているのはごくわずかです16,17。ラットの血管のカニューレ挿入を必要とする従来の方法は、マウスで行うのは技術的に困難です。さらに、これらの方法によって収集される血液の最大量は、通常、0.3mL以下である18

この論文では、マウスIVCから同じ動物でPVに続く二重採血のプロセスを簡素化する新しい方法を紹介します。この方法のユニークな特徴は、PV採血の直前に肝門の近くでPVをライゲーションすることです。このアプローチにより、PVの寸法を拡大できるため、成功率が大幅に向上し、最大収集可能な血液量が最大0.5mLまで増加します。

Protocol

この非生存手順のすべてのステップは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。マウスの性別と系統は、C57BL/6Jマウスの雄(体重25-35g、生後12-15週齢)とした。雌および/または他の標準的なマウス系統も使用できます。 1.麻酔 マウス腹部の下半分を70%エタノール綿棒?…

Representative Results

上記の方法を用いることで、IVCとPVから血液サンプルを同じマウスで順次採取することができ、成功率は95%を超えています。採取される血液サンプルの平均量は、IVCで0.25 mL、PVで0.35 mLです。 ガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)を用いて、糞便、PV血液、IVC血液中のSCFAsの濃度を測定し、腸内細菌の発酵によって生成される大腸コンパートメ?…

Discussion

この論文では、同じ実験マウスでIVCとPVから血液サンプルをほぼ同時に採取するための革新的な in vivo 法について説明します。この方法は、門脈循環を通過するSCFAなどの腸内細菌叢生成産物のレベルを測定するのに役立ちます。マウス(体重25〜30g)の終末処置中に収集できる血液の平均最大量は、マウスあたり約1mLであり、これは総循環血液量の50%に相当する<s…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

APは、NIH / NHLBI(1R01HL146753)からのR01賞によって資金提供されています。DMは、NIHのT32フェローシップと、UCSFベニオフマイクロバイオーム医学センターの研修生/スタッフパイロット賞によって資金提供されています。

Materials

2,2,2 Tribromoethanol, 97% (Avertin) Sigma Aldrich  T48402-25G Anesthetic agent 
Buprenorphine Hydrochloride Injection 0.3 mg/mL PAR Pharmaceutical  NDC 42023-179-05 Analgesic agent
Dressing Forceps Miltex  6-100 Dissection 
Graefe Forceps Roboz RS-5136 Dissection 
Hepatin sodium 1000 USP units/mL Hikma NDC 0641-0391-12 Blood sample syringes/tubes heparinization
Prolene 7-0 Ethicon 8696G Portal vein ligature
Scissors F.S.T 14058-11 Dissection 
Student Halsted-Mosquito Hemostats F.S.T  91308-12 Dissection 
Surgical tape  3M Transpore 1527-1 Mouse limbs fixation
U-100 Insulin Syringe 28G1/2 EXEL 26027 Blood sample collection 

参考文献

  1. vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
  2. Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
  3. Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
  4. Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
  5. den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
  6. Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159 (2019).
  7. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
  8. De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
  9. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
  10. Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
  11. Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
  12. Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
  13. Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
  14. Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
  15. Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185 (2016).
  16. Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456 (2018).
  17. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985 (2023).
  18. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  19. Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
  20. Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
  21. Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55 (2018).
  22. Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657 (2018).
  23. Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108 (2017).
  24. Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55 (2018).
  25. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955 (2014).
  26. Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice – Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798 (2015).
  27. Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4 (2017).

Play Video

記事を引用
Doan, T. N. M., Maruyama, D., Tian, X., Prakash, A. Sequential Blood Collection from Inferior Vena Cava Followed by Portal Vein to Evaluate Gut Microbial Metabolites in Mice. J. Vis. Exp. (208), e66673, doi:10.3791/66673 (2024).

View Video