Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

동물을 대상으로 한 모든 실험은 이전에 발렌시아 대학의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (스페인)의 승인을 받았습니다. 1. 신경구의 1차 문화 시약의 준비탈이온수에 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Saline Buffer)의 완충 용액을 준비하고 고압멸균으로 멸균합니다. 또는 탈이온수에 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mMNa2HPO4 및 1.8mMKH2PO4용액을 첨가하여 0.1M PBS pH 7.4를 준비합니다. 두 개의 12웰 플레이트에 이전에 냉각된 DPBS를 채우고 얼음 위에 보관합니다: 하나는 절개 전에 뇌 전체를 보존하는 데 사용되고, 다른 하나는 조직이 처리될 때까지 절개된 SVZ를 보존하는 데 사용됩니다. 아래 설명에 따라 파파인 함유 효소 혼합물을 준비합니다.Earl’s Balanced Salt Solution(EBSS)에서 각각 0.2mg/mL의 최종 농도로 EDTA/L-시스테인 해리 용액을 준비합니다. 완전히 용해되려면 튜브를 37°C의 수조에서 배양합니다. 파파인 12U/mL를 EDTA/L-시스테인 용액에 녹입니다. 뇌 당 500 μL의 효소 용액이 사용된다고 가정하십시오. 효소가 완전히 용해될 때까지 37°C의 수조에 파파인 용액을 약 20분 동안 넣습니다. 주사기와 0.22μm-기공 필터로 효소 혼합물을 필터 멸균하고 사용할 때까지 4°C에서 유지합니다.알림: 파파인은 37°C에서 30분 후에 활성화되며 4°C에서 12시간 동안 보관할 수 있습니다. 표 1에 따른 호르몬 혼합액을 첨가하여 대조배양액을 제조하고 니트로셀룰로오스 0.22μm-pore 필터를 사용하여 여과-멸균한다. 매체를 4 °C로 유지하고 사용하기 전에 37 °C의 수조에서 데우십시오. 표 1에 따라 사용하기 직전에 대조 매체에 EGF 및 bFGF를 보충하여 전체 배지를 준비합니다. 필터링으로 미토겐이 손실될 수 있으므로 전체 매체를 필터링하지 마십시오. 뇌 적출 및 SVZ 해부참고: 쥐는 안락사 전에 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 8주에서 16주령의 C57BL/6 마우스가 사용됩니다. 남녀 모두 준비에서 눈에 띄는 차이없이 사용됩니다.수술 전에 고압멸균으로 해부 도구를 멸균하십시오. 그런 다음 메스, 핀셋, 가위, 주걱을 70% 에탄올로 채워진 비커에 담그십시오. 70% 에탄올로 모든 작업 표면을 철저히 청소하십시오. CO2 과다 복용으로 마우스를 희생하고 자궁 경부 탈구로 확인합니다. 뇌 조직 오염 가능성을 최소화하기 위해 머리에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위를 사용하여 쥐의 머리를 몸의 나머지 부분과 분리합니다. 두개골이 완전히 드러날 때까지 로스트로-꼬리 축을 따라 작은 가위로 두개골 위의 피부를 자릅니다. 먼저 작은 가위로 시상 봉합사를 따라 두개골을 잘라 뇌를 노출시킨 다음 가는 핀셋을 사용하여 뼈를 제거합니다. 이 단계에서 두개골 아래의 뇌 조직에 손상을 입히지 않도록 주의하십시오. 주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 조심스럽게 추출하고 차가운 DPBS가 들어 있는 12웰 플레이트에 넣습니다. 해부가 완료될 때까지 접시를 얼음 위에 두십시오. 뇌 전체를 박리가 진행될 실리콘 패드에 옮기고 뇌에 차가운 DPBS 몇 방울을 떨어뜨립니다(그림 1A). 메스를 사용하여 뇌의 말단에 위치한 OB와 꼬리 부분에 위치한 소뇌를 제거하면서 양쪽 측면 심실을 포함하는 뇌의 중앙 부분을 유지합니다(그림 1B). 세로 균열을 따라 뇌를 두 개의 반구로 나눈 다음 두 반구를 개별적으로 절개합니다(그림 1C). 한쪽 반구로 작업하면서 중간 영역이 위쪽을 향하도록 방향을 바꿉니다. 뇌량(corpus callosum)을 따라 뇌를 열어 피질과 선조체를 해마, 중격, 간뇌에서 분리하여 외측 심실을 노출시킵니다(그림 1D).알림: SVZ는 심실의 구멍과 선조체 사이에 위치하므로 후속 단계는 SVZ를 주변 조직에서 가능한 한 정확하게 격리하는 것을 목표로 합니다. 심실의 복부 한계를 따라 해마, 중격 및 간뇌를 제거하고(그림 1E,F), SVZ의 로스트랄 및 꼬리 끝 너머의 조직(그림 1G), 뇌량(corpus callosum)을 따르는 피질(그림 1H,I)을 제거합니다. SVZ가 옆을 향하도록 조직을 기울여(그림 1J) SVZ 아래의 선조체 조직을 제거하여(그림 1K) NSC를 포함하는 얇은 조직 조각을 얻을 수 있습니다(그림 1L). 조직 처리가 시작될 때까지 동일한 마우스에서 절개된 두 SVZ를 모두 차갑고 멸균된 DPBS가 들어 있는 12웰 플레이트에 보관합니다.참고: 한쪽 뇌에서 두 SVZ를 모두 절제하는 데 10분이 소요됩니다. 시간이 길면 세포 생존율에 영향을 미칠 수 있습니다. 배양액의 수율을 증가시켜야 하는 경우, 동일한 연령, 성별, 유전적 배경 및 유전자형을 가진 여러 마우스의 SVZ를 풀링할 수 있습니다. NSC의 격리 및 시딩(Isolation and seeding)조직의 응집을 용이하게 하기 위해 각 SVZ를 4-5개의 작은 조각으로 자릅니다.참고: 이 단계부터 전체 절차는 층류 후드의 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 멸균 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 잘게 잘린 SVZ를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 접시에 파편이 남아 있지 않은지 확인하십시오. 튜브 바닥에 조직 침전물을 넣고 남아 있는 DPBS를 제거합니다. 브레인당 여과된 파파인 함유 효소 혼합물 500μL(SVZ 2개)를 추가하고 튜브를 37°C의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 37°C에서 사전 예열된 대조 배지 5mL를 각 샘플에 추가합니다. 샘플을 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 마이크로피펫이나 진공 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 대조 매체 1mL를 추가하고 균질한 세포 현탁액이 얻어질 때까지 화염 광택 처리된 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 10배에서 20배까지 위아래로 피펫팅하면서 펠릿을 기계적으로 조심스럽게 분해합니다.주의: 이는 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나이며, 과도하거나 불충분한 세분화는 배양물의 수율에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다. 대조 배지 4mL를 추가하고 반전으로 혼합하여 세포를 세척합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 그런 다음 상층액을 제거합니다. 1mL의 완전한 배지를 추가하고 세포 현탁액을 균질화하기 위해 위아래로 10배 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 현탁액의 부분 표본을 트리판 블루로 1/2 희석한 후 현미경 아래의 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 현탁액을 계산하거나 자동 세포 카운터를 활용합니다. 배양액이 단일 세포 수준에서 세분화되어 있는지 확인합니다. 세포 현탁액이 준비되면 얻은 세포를 500μL의 완전한 배지의 최종 부피에서 48웰 플레이트의 8웰에 동일하게 파종합니다.참고: 일반적으로 두 개의 SVZ에서 20,000개의 세포를 얻어 최종 파종 밀도는 약 2,500 cells/mL로 배양에서 최대 수율을 달성합니다. 신경구 형성37 ° C 및 5 % CO2 의 가습 된 인큐베이터에서 5-7 일 동안 in vitro (DIV) 동안 세포를 배양합니다. 이러한 조건 하에서, 분화된 세포는 죽는 동안 NSC와 전구세포는 유사분열 자극에 반응하여 증식하여 일차 신경구로 인식되는 클론 응집체를 형성합니다.참고: EGF 또는 bFGF를 사용하여 신경구 형성을 유도할 수 있습니다. 그러나 이 두 가지 성장 요인을 완전히 대체할 수 있는 것은 아닙니다. 도립 현미경 결합 카메라를 사용하여 신경구의 크기를 확인하고 신경구가 50-100 μm의 크기 범위에 도달하면 우물에서 형성된 모든 주요 신경구를 10배 배율로 계산합니다. 형성된 1차 신경구의 총 수는 SVZ 틈새에 존재하는 NSC의 수를 추정하는 역할을 합니다. 10일이 지나면 각 웰에서 배양 배지를 채취하여 패시징을 시작합니다. 5-7 DIV 후에 후속 passaging을 수행하지만, 1차 구체가 subculturing에 이상적인 크기(약 100μm)에 도달하는 데 약간 더 긴 기간이 필요할 수 있다는 점에 유의할 가치가 있습니다. 표 1: 배양 배지 솔루션. 제어 매체의 조리법이 설명되어 있습니다. 미리 혼합된 호르몬 혼합 용액이 만들어집니다. 스톡 호르몬 용액은 표시된 대로 미리 준비하고 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 세포 배양 전에 대조 배지에 EGF 및 bFGF를 보충하여 완전한 배지를 준비합니다. 저장 사양, 재고 및 작업 농도는 각 구성 요소에 대해 제공됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 2. 신경권 문화의 확장 신경구의 통로멀티웰 플레이트에서 신경구를 포함하는 배지를 수집하여 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 몇 밀리리터의 DPBS로 웰을 헹구어 가능한 한 많은 세포의 회수를 보장합니다. 300 x g에서 5분 동안 신경구를 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 펠릿에 200μL의 효소 용액( 재료 표 참조)을 추가하고 튜브 바닥을 가볍게 두드려 제거합니다. 신경구 해리를 촉진하기 위해 실온에서 10분 동안 배양합니다. 대조 배지 1mL를 추가하여 효소 반응을 중단하고 P1000 마이크로피펫으로 10배에서 20배까지 위아래로 피펫팅하여 신경구를 기계적으로 해리합니다. 대조 배지 4mL를 추가로 추가하고 반전으로 혼합하여 세포를 세척합니다. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 1mL의 완전한 배지를 추가하고 펠릿을 재현탁시켜 세포 현탁액을 10회 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다.참고: 신경구의 원래 수와 크기가 너무 높으면 신뢰할 수 있는 세포 수를 보장하기 위해 세포 현탁액을 희석하기 위해 더 완전한 배지를 추가하십시오. 세포 현탁액의 부분 표본 1/2을 트리판 블루로 희석한 후 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 현탁액을 계산하거나 자동 세포 카운터를 사용합니다. 세포 배양을 확장하려면 적절한 배양 플레이트 또는 플라스크에 완전한 배지를 사용하여 10,000 cells/cm2 밀도로 세포를 파종합니다( 표 2 참조). 37 ° C 및 각 통로에 대해 5 % CO2 의 가습 인큐베이터에서 5-7 DIV의 세포를 배양합니다.참고: Neurosphere 배양은 증식 능력을 변경하지 않고 10개 통로를 초과하지 않는 반복적인 하위 배양을 통해 일관되게 확장 및 증식할 수 있습니다. EGF 또는 bFGF는 배양에 사용할 수 있습니다. 그러나 배양의 장기적인 확장은 EGF가 있을 때만 달성할 수 있습니다. 자가 갱신 분석신경구 배양을 통과시킨 후 96웰 플레이트에 1,000개의 개별 세포를 패팅하고 완전한 배지로 최대 200μL의 최종 부피를 완성하여 5개 cells/μL 배양의 최종 세포 밀도를 만듭니다.참고: 시드된 셀의 수는 가능한 한 정확해야 합니다. 필요한 경우 도금 전에 신뢰할 수 있는 셀 현탁액 부피를 보장하기 위해 중간 희석액을 준비합니다. 또한 기술적 변동성을 줄이기 위해 조건당 4-5번의 반복을 플레이트하는 것이 좋습니다. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 5 일 동안 또는 신경 구체가 적절한 크기 (60-100 μm)에 도달 할 때까지 세포를 배양합니다. 신경구 응집을 방지하기 위해 멀티웰 플레이트를 움직이거나 흔들지 마십시오. 신경구 형성 후 부착된 카메라가 장착된 도립 위상차 현미경을 사용하여 각 웰에 형성된 신경구의 수를 계산합니다. 자가 재생 분석은 EGF 또는 bFGF를 별도로 사용하여 수행할 수 있습니다. NSC 배양물의 냉동 보존참고: Neurosphere 배양은 향후 사용을 위해 냉동 보존할 수 있어 필요한 마우스 수를 최소화할 수 있습니다. 통로 10까지 세포를 보존하는 것이 좋습니다.세포를 동결 보존하려면 완전한 배지에 담긴 세포 현탁액 1mL를 적절하게 라벨링된 극저온 튜브에 옮깁니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 셀 현탁액에 최종 농도 10%로 첨가하고 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합합니다.참고: DMSO는 동결 보호제 역할을 하지만 세포에 독성이 있을 수 있으므로 이 단계를 신속하게 수행해야 합니다. 80°C/min에서 온도를 점진적으로 낮출 수 있는 냉동 용기를 사용하여 튜브를 -1°C 냉동고에 넣습니다. 이 점진적인 동결 과정은 냉동 보존 중 얼음 결정의 형성으로 인한 세포 손상을 방지합니다. 장기 보관을 위해 튜브를 -196°C의 액체 질소 탱크에 보관하십시오. NSC 문화의 해동참고: 필요한 경우 세포를 해동하고 실험을 위해 배양액을 다시 확장할 수 있습니다.액체 질소 저장 탱크에서 동결된 NSC가 들어 있는 극저온 튜브를 제거하고 즉시 37°C 수조에 넣고 약 5분 동안 완전히 해동될 때까지 넣습니다.주의: DMSO는 독성이 있고 세포 생존력에 영향을 줄 수 있으므로 수조 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 해동된 세포를 5mL의 사전 예열된 대조 매체가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 빠르게 옮깁니다. 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 1mL의 완전한 배지를 추가하고 파종하기 전에 세포 현탁액을 균질화하기 위해 위아래로 10배 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다.알림: 해동은 세포 생존력에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 새로운 실험을 위해 씨를 뿌리기 전에 적어도 한 번은 세포를 통과시키는 것이 좋습니다. 마이코플라스마 검사참고: 마이코플라스마 오염은 세포 건강을 손상시켜 성장 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 마이코플라스마 검사는 실험의 무결성과 신뢰성을 보장하는 데 매우 중요합니다.DNA 추출DNA 추출을 위해 최소 100μL의 세포 배양을 수집합니다. 상층액과 세포 펠릿 모두 DNA 추출에 사용할 수 있습니다. 추출할 때까지 이 부분 표본을 -20 °C에서 보관하십시오. 튜브 뚜껑을 뚫고 써모블록을 사용하여 분취액을 99°C에서 15분 동안 끓입니다.알림: 튜브 뚜껑을 뚫으면 고온에서 끓는 동안 튜브가 열리는 것을 방지할 수 있습니다. 16,900 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. DNA를 포함하는 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. PCR 검사 전까지 DNA가 있는 튜브를 -20°C에서 보관합니다. 마이코플라스마 검출을 위한 PCR10 μM 농도에서 8.9 μL의 뉴클레아제-프리 물, 3 μL의 5x 반응 완충액, 1.2 μL의 25 mM MgCl2, 0.25 μL의 2.5 mM dNTPs, 0.15 μL의 Taq 중합효소 및 0.25 μL의 각 마이코플라스마 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 혼합물을 준비합니다(정방향, Fw: 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ 및 역방향, Rv: 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3′)입니다. 게놈 추출 DNA 1μL를 추가합니다. DNA 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 PCR 혼합물을 준비합니다. 95°C에서 5분 동안 초기 변성한 후 95°C에서 30초 동안 35주기 변성, 53°C에서 1분 동안 어닐링, 72°C에서 30초 동안 연장, 72°C에서 5분 동안 최종 연장. 생성된 띠의 크기(약 500bp)를 식별하려면 3μL의 6x 로딩 염료 용액과 혼합된 DNA PCR 산물 15μL를 2% 아가로스 겔에 로드하고 100V에서 40-50분 동안 전기영동을 실행합니다. 표 2: 배양에 사용되는 플레이트 및 플라스크. 가장 일반적으로 사용되는 파종 플레이트와 플라스크의 치수와 부피가 제공됩니다. 이 표에는 각 용기에 사용되는 직경, 성장 면적 및 매체 부피와 함께 확장 조건(10,000 cells/cm2)에서 파종할 NSC 수의 예가 포함되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 3. 신경권 배양의 핵융합 시약의 준비DNA 준비형질전환을 위해 1.5mL 튜브에 25μL의 유능한 E. coli DH5α 세포를 준비합니다. 관심 플라스미드 1 μL(100 – 200 ng/μL)를 세포에 추가하고 42°C에서 45초 동안 열 충격을 가합니다. 여기서, Snrpn 발현을 침묵시키기 위한 short hairpin (sh)RNA를 함유하는 플라스미드와 control plasmid shSCRAMBLE이 사용된다.알림: 변형 효과를 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 유능한 세포를 얼음 위에 유지하십시오. 형질전환된 세포를 LB 한천 플레이트에 적절한 항생제를 도포하고 37°C에서 18시간 동안 배양합니다. 박테리아 식민지를 방해할 수 있는 결로로 인한 물방울 형성을 방지하기 위해 페트리 접시를 뒤집어 두십시오.참고: LB 배양 배지에 적절한 항생제를 첨가하여 형질전환된 박테리아가 독점적으로 성장할 수 있도록 합니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 개별 박테리아 콜로니를 선택하고 이전에 250mL의 LB로 채워진 Erlenmeyer 플라스크로 옮겨 액체 배양을 시작합니다. 더 큰 타겟 콜로니 주변에 위치한 작은 위성 콜로니는 원하는 플라스미드를 통합하지 않았을 수 있으므로 선택하지 마십시오. 밤새 37°C의 궤도 셰이커에서 세게 흔들면서 플라스크를 배양합니다. 내독소가 없는 maxiprep 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 박테리아 배양에서 순수한 플라스미드 DNA를 추출합니다. 적절한 양의 내독소가 없는 물에서 DNA를 재구성하여 1 – 2 μg/μL의 플라스미드 농도를 얻습니다.참고: maxiprep 수율은 배양 성장에 따라 달라집니다. 일반적으로 플라스미드 DNA 펠릿을 200 μL의 부피로 재현탁시키면 원하는 DNA 농도가 생성됩니다. 플라스미드 DNA가 있는 튜브를 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오. nucleofection을 위한 2 내지 6 μg의 플라스미드 DNA를 포함하는 최종 부피가 5 μL인 1.5 mL 튜브를 준비합니다. 재료 준비핵 용액을 준비합니다. 권장 키트( 재료 표 참조)를 사용하는 경우 원하는 각 핵에 대해 95mL 튜브에 1.5μL의 핵절용 용액을 준비합니다. 피펫과 큐벳은 일반적으로 키트에 포함되어 있습니다. 모든 핵 상태에 대해 각각 하나씩 준비합니다. 조건에 따라 25mL의 사전 예열된 완전한 배지 4mL로 채워진 T4 플라스크를 준비하고 사용할 때까지 인큐베이터에 보관합니다. NSC의 핵평가를 위해 조건당 1 – 2 x 106 개의 개별 셀을 사용합니다. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다. 1mL의 DPBS를 추가하고 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 위아래로 10배 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다. 두 번째 세척을 위해 원심분리(단계 2.1.6)를 반복하고 마지막으로 펠릿을 95μL의 핵절용 용액에 재현탁시킵니다.알림: 세척 단계는 대조 매체에서 항생제를 제거하고 효과적인 핵검사를 보장하는 데 중요합니다. 95 μL의 세포를 뉴클레오펙션을 위해 선택된 각 플라스미드 5 μL(총 2 μg)를 포함하는 사전 혼합 용액과 결합합니다. P200 마이크로피펫을 사용하여 이 용액을 큐벳으로 옮기고 뉴클레펙터 장치에 넣습니다. nucleofector 시스템의 최적화된 NSC 프로그램을 사용하여 원하는 plasmid로 세포를 Nucleofect합니다. 전기천공법을 완료한 후 키트에 제공된 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳에 따뜻한 완전한 매체를 조심스럽게 주입합니다. 그 후, 큐벳의 내용물을 사전 예열된 완전한 매체가 들어 있는 미리 준비된 T25 플라스크로 옮깁니다. 전기천공법 후에는 세포 사멸, DNA 침전 및 점성 응집체의 형성이 있을 수 있습니다. 세포 생존율을 감소시킬 수 있으므로 이를 T25 플라스크로 옮기지 마십시오.참고: 이 단계는 매우 중요하며 높은 수율의 핵절제와 후속 배양 생존을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 37 °C 및 5 % CO2에서 가습 된 인큐베이터에서 3-5 일 동안 핵 세포를 배양합니다. nucleofected 세포의 선택전략 A: 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통한 유세포 분석 선택3-5 일의 nucleofection 후, 단계 2.1에 따라 nucleofected 배양물을 통과시키고 얻어진 모든 개별화 된 세포를 수집한다. 40μm 세포 여과기를 통해 샘플을 여과하여 세포 응집체를 제거하고 세포 분류기 유세포분석기로 분석합니다.참고: 비교 결과를 얻으려면 각 조건에서 동일한 수의 셀을 정렬하는 것이 중요합니다. cytometer의 소프트웨어를 사용하여 세포 크기에 해당하는 전방 산란광(FSC-A)과 세포 내 복잡성에 해당하는 측면 산란광(SSC-A)의 두 가지 측정에 따라 살아있는 세포를 게이트합니다. 높은 FSC-A 및 높은 SSC-A를 특징으로 하는 살아있는 세포의 집단을 선택합니다.참고: 선택적으로 분류하기 전에 0.1μg/mL의 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 세포 현탁액에 추가합니다. 이렇게 하면 게이팅에서 죽은 세포와 자가사멸체를 버릴 수 있습니다. FSC-A 파라미터와 FSC-H 파라미터를 플로팅하여 셀 doublet과 triplet을 버립니다. 플롯의 대각선에 포함된 사건을 선택하여 singlet을 나타냅니다.참고: 세포가 레이저를 통과할 때 유세포분석기는 시간 경과에 따른 전압 변화를 감지합니다. FSC-A는 신호 면적을 나타내고 FSC-H는 피크 높이를 나타냅니다. 단일항은 FSC-A와 FSC-H(플롯의 대각선에 위치) 사이의 비례 관계를 보여주는 반면, 셀 응집체는 신호가 더 길기 때문에 FSC-H에 비해 더 큰 FSC-A를 표시합니다. 사용된 플라스미드에 의해 인코딩된 리포터 유전자의 형광 강도를 기반으로 nucleofected 세포를 선택합니다. 예를 들어, GFP+를 사용할 때 FITC-A 형광 수준과 SSC-A 플롯에 따라 세포를 선택할 수 있습니다. 각 조건에 대해 원하는 수의 표적 세포를 분리하고 완전한 배지로 채워진 수집 튜브에 직접 수집합니다. 10,000 cells/cm의 밀도에서 NSC를 종자합니다.2. 가습 인큐베이터에서 37 °C 및 5 % CO2 에서 분류 된 세포 배양을 배양합니다. 전략 B: 플라스미드에 인코딩된 항생제 내성을 이용한 선별48시간의 핵절용 후 내성 세포를 선택하기 위해 적절한 농도의 항생제를 추가합니다.알림: 시작하기 전에 비핵계 세포에 대해 여러 농도의 항생제를 테스트하는 것이 좋습니다. 최적의 항생제 농도는 모든 비내성 세포가 제거되는 가장 낮은 양입니다. 예를 들어, NSC 배양에 대한 4μg/mL 항생제 블라스티딘의 최적 농도를 측정했습니다. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 48 시간 동안 세포를 배양합니다. 항생제 처리 48시간 후, 단계 2.1에 따라 핵절충된 세포를 계배양합니다. 신경구가 작게 유지되면 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 배양 배지에서 항생제를 제거합니다. 세포를 재현탁시키고 완전한 배지만 사용하여 플라스크에서 배양합니다. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 2.1 단계 에 따라 확장 할 수 있을 때까지 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.