JoVE Journal > Neuroscience
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神経科学

Isolatie, expansie en nucleofectie van neurale stamcellen uit de subventriculaire zone van volwassen muizen

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66651
, , , , , , ,
1Instituto de Biotecnología y Biomedicina (BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física,Universitat de València

概要

Hier beschrijven we een nucleofectiesysteem dat is ontworpen om de efficiëntie van genafgifte te verbeteren in uitgebreide neurale stamcellen (NSC’s) geïsoleerd uit de subventriculaire zone van volwassen muizen. De bevindingen tonen aan dat deze methode de genverstoring in NSC’s aanzienlijk verbetert, de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen overtreft en de celoverleving verbetert.

Abstract

Isolatie en expansie van neurale stamcellen (NSC’s) uit de subventriculaire zone (SVZ) van de hersenen van volwassen muizen kan worden bereikt in een medium aangevuld met basisfibroblastgroeifactor (bFGF) en epidermale groeifactor (EGF) als mitogenen, waardoor klonale aggregaten worden geproduceerd die bekend staan als neurosferen. Dit in vitro systeem is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van het NSC-potentieel. Transfectie van siRNA’s of genen die in plasmiden worden gedragen, kan worden gebruikt om verstoringen van genexpressie te induceren en NSC-biologie te bestuderen. De exogene nucleïnezuurafgifte aan NSC-culturen is echter een uitdaging vanwege de lage efficiëntie van de transfectie van cellen van het centrale zenuwstelsel (CZS). Hier presenteren we een verbeterd nucleofectiesysteem dat een hoge efficiëntie van genafgifte bereikt in verlengde NSC’s van SVZ van volwassen muizen. We tonen aan dat deze relatief eenvoudige methode de genverstoring in volwassen NSC’s verbetert, en de traditionele transfectieprotocollen overtreft met overlevingspercentages van meer dan 80%. Bovendien kan deze methode ook worden toegepast in primaire geïsoleerde NSC’s, wat een cruciale vooruitgang biedt in genfunctiestudies door middel van manipulatie van genexpressie via knockdown of overexpressie in neurosfeerculturen.

Introduction

Neurale stamcellen (NSC’s) zijn multipotente stamcellen die zich in de hersenen bevinden. Deze cellen bezitten het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in de drie neurale lijnen: astrocyten, oligodendrocyten enneuronen. Bijgevolg spelen NSC’s een cruciale rol bij de neurogenese van volwassenen bij zoogdieren, een proces waarbij nieuwe neuronen in de hersenen worden gegenereerd2. NSC’s bevinden zich voornamelijk in twee regio’s binnen de volwassen hersenen die neurogene niches worden genoemd: de subventriculaire zone (SVZ) langs de wanden van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) binnen de dentate gyrus van de hippocampus 3,4. NSC’s (ook bekend als B-cellen) in de SVZ, de meest actieve neurogene niche in de volwassen muis, vernieuwen zichzelf en produceren transit-amplificerende voorlopercellen (TAP’s of C-cellen) die vervolgens differentiëren tot neuroblasten (A-cellen). Deze neuroblasten migreren via de rostrale migratiestroom (RMS) naar de olfactorische bollen (OB), waar ze volledige differentiatie ondergaan in interneuronen en integreren in de reeds bestaande circuits 3,4,5,6.

Het begrijpen van het ingewikkelde samenspel van moleculaire signalen en signalen die NSC’s binnen deze niches reguleren, is belangrijk om hun potentieel voor therapeutische toepassingen te benutten. Voor dat doel zijn verschillende methoden ontwikkeld om deze celpopulatie te bestuderen, variërend van selectieve primaire cultuur van NSC’s tot celselectie met behulp van oppervlaktemarkers 7,8,9,10. Het huidige manuscript beschrijft de isolatie en kweek van SVZ NSC’s in vitro met behulp van een serumvrij selectief medium dat beide mitogenen bevat: basisch fibroblast groeifactor (bFGF) en epidermale groeifactor (EGF). Dit medium vergemakkelijkt de celproliferatie en handhaaft de stam van NSC’s die zijn verkregen uit de SVZ van volwassen muizenhersenen die in vitro klonale, driedimensionale, niet-hechtende aggregaten vormen die bekend staan als neurosferen9. Neurosfeerculturen dienen als een gecontroleerd platform voor het manipuleren en bestuderen van de moleculaire mechanismen en factoren die van invloed zijn op NSC-proliferatie, zelfvernieuwing, differentiatie en overleving11. Met name het aantal primaire neurosferen dat in de cultuur wordt gevormd, maakt een schatting mogelijk van het aantal NSC’s dat in vivo in de SVZ aanwezig is, waardoor het een krachtig hulpmiddel is voor het bestuderen van de effecten van verschillende aandoeningen op de volwassen NSC-pool12,13. Bovendien kunnen NSC’s, zodra de primaire cultuur is gevestigd, nieuwe aggregaten (secundaire neurosferen) genereren bij het passeren van symmetrische delingen onder proliferatieomstandigheden14. Het zaaien van secundaire neurosfeercellen met lage dichtheid (klonale test) kan dus worden gebruikt om de zelfvernieuwingssnelheid van deze culturen te beoordelen 4,15,16,17.

Ondanks het potentieel van neurosferen bij het blootleggen van de mechanismen die de NSC-regulatie beheersen, twijfelen sommige onderzoekers aan de geldigheid van in vitro bevindingen, met het argument dat de kunstmatige omstandigheden waarin cellen groeien mogelijk niet getrouw de ingewikkelde in vivo micro-omgeving van neurogene niches repliceren 18,19,20,21,22. Een ander controversieel punt draait om de waargenomen heterogeniteit in neurosferen. Desalniettemin wordt aangenomen dat deze variabiliteit een weerspiegeling is van de symmetrische en asymmetrische verdelingen van de NSC’s die van nature in vivo voorkomen 23,24. Bovendien heeft recente validatie het gebruik van NSC-culturen ondersteund om mechanismen te voorspellen die in vivo binnen de SVZ-neurogene niche werken, en verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat NSC’s die in vitro worden gekweekt, het in vivo waargenomen transcriptomische profiel nauwkeurig behouden 11,25.

Daarom dienen neurosfeerculturen niet alleen als een methode om NSC-proliferatie en differentiatievermogen te onderzoeken, maar bieden ze ook een systeem om de invloed van genen die de NSC-biologie beheersen te bestuderen. Een cruciale techniek voor het onderzoeken van de genfunctie in NSC’s is verstoring van genexpressie. siRNA’s of genen die via plasmiden worden afgeleverd, kunnen worden getransfecteerd in celculturen, wat resulteert in knockdown of opregulatie van het doelgen. Deze veelzijdige aanpak vermindert de tijd en kosten aanzienlijk in vergelijking met het opzetten van culturen met behulp van voorwaardelijke knock-outmuizen, wat een veelbelovende weg biedt voor het ontrafelen van de genetische basis van neurogenese en het verkennen van therapeutische vooruitzichten. Het veranderen van de expressie van specifieke genen in NSC’s maakt de modulatie van hun gedrag mogelijk, waardoor cruciale biologische processen zoals proliferatie, differentiatie en migratie worden beïnvloed. Het vooruitzicht van transfectie van NSC’s, met name in de neurosferen van muizen, brengt echter opmerkelijke uitdagingen met zich mee. De driedimensionale structuur van neurosferen brengt de efficiëntie van transfectie in gevaar, wat vaak resulteert in lage percentages van succesvolle exogene nucleïnezuurafgifte, wat de mate van genetische manipulatie beperkt26,27. Bovendien kunnen transfectieprocedures de levensvatbaarheid en functionaliteit van cellen nadelig beïnvloeden27. In deze context presenteren we het nucleofectiesysteem als een methode om celbeschadiging te verminderen, een hoog overlevingspercentage te bereiken en een hogere werkzaamheid te garanderen in genafgiftetesten die worden gebruikt om NSC-culturen te verstoren.

Dit manuscript heeft tot doel de procedure te illustreren voor het isoleren, uitbreiden en nucleofecteren van NSC’s uit de volwassen SVZ-neurogene niche om genen te verstoren met behulp van het neurosfeercultuursysteem. Deze methode overtreft de effectiviteit van traditionele transfectieprotocollen en biedt aanzienlijk hogere overlevingspercentages en een verbeterde efficiëntie van de genafgifte onder de beoogde cellen.

Protocol

Alle experimenten die met dieren werden uitgevoerd, waren eerder goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Valencia en geautoriseerd door Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (Spanje). 1. Primaire cultuur van neurosferen Bereiding van reagentiaBereid een bufferoplossing van Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) in gedeïoniseerd water en steriliseer door autoclaveren. U kunt ook 0,1 M PBS pH 7,4 bereiden door 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 en 1,8 mM KH2PO4-oplossing toe te voegen aan gedeïoniseerd water. Vul twee platen met 12 putjes met eerder gekoelde DPBS en bewaar ze op ijs: de ene zal worden gebruikt om de hele hersenen te bewaren vóór dissectie, en de andere zal ontlede SVZ’s bewaren tot weefselverwerking. Bereid een papaïnebevattende enzymatische mix zoals hieronder beschreven.Bereid EDTA/L-cysteïne-dissociatieoplossing in Earl’s Balanced Salt Solution (EBSS) tot een eindconcentratie van 0,2 mg/ml elk. Om een volledige oplossing te bereiken, incubeert u de buis in een waterbad bij 37 °C. Los 12 E/ml papaïne op in EDTA/L-cysteïne-oplossing. Bedenk dat er 500 μL enzymatische oplossing per brein wordt gebruikt. Breng de papaïneoplossing in een waterbad van 37 °C gedurende ongeveer 20 minuten totdat het enzym volledig is opgelost. Filtreer het enzymatische mengsel met een spuit en een filter met 0,22 μm-poriën en houd het tot gebruik op 4 °C.OPMERKING: Papaïne wordt geactiveerd na 30 minuten bij 37 °C en kan 12 uur bij 4 °C worden bewaard. Bereid het controlecultuurmedium voor door de hormoonmengoplossing volgens tabel 1 toe te voegen en filtreer en steriliseer het met nitrocellulosefilters van 0,22 μm-poriën. Houd het medium op 4 °C en verwarm het voor gebruik in een waterbad op 37 °C. Bereid het volledige medium voor door het controlemedium vlak voor gebruik aan te vullen met EGF en bFGF zoals vermeld in tabel 1. Filtreer niet het volledige medium, omdat mitogenen bij het filteren verloren kunnen gaan. Hersenextractie en SVZ-dissectieOPMERKING: Muizen hebben vrije toegang tot voedsel en water voorafgaand aan euthanasie. Er worden C57BL/6-muizen gebruikt die 8 tot 16 weken oud zijn. Beide geslachten worden gebruikt zonder merkbare verschillen in de bereiding.Steriliseer de dissectie-instrumenten door ze vóór de operatie te autoclaveren. Dompel vervolgens scalpels, pincetten, scharen en spatels onder in een bekerglas gevuld met 70% ethanol. Reinig elk werkoppervlak grondig met 70% ethanol. Offer de muis op door een overdosis CO2 en bevestig door cervicale dislocatie. Spuit het hoofd in met 70% ethanol om de kans op besmetting van hersenweefsel te minimaliseren. Scheid het hoofd van de muis van de rest van het lichaam met een schaar. Knip de huid boven de schedel af met een kleine schaar langs de rostro-caudale as totdat de schedel volledig onbedekt is. Leg de hersenen bloot door eerst de schedel langs de sagittale hechting te knippen met een kleine schaar en vervolgens de botten te verwijderen met een fijn pincet. Zorg ervoor dat u tijdens deze stap geen schade toebrengt aan het hersenweefsel onder de schedel. Haal de hersenen voorzichtig uit de schedel met behulp van een spatel en plaats deze in een plaat met 12 putjes met koude DPBS. Houd de plaat op ijs totdat de dissectie is voltooid. Breng de hele hersenen over op het siliconenkussentje waar de dissectie zal plaatsvinden en breng een paar druppels koude DPBS aan op de hersenen (Figuur 1A). Gebruik een scalpel om de OB aan het rostrale uiteinde van de hersenen en het cerebellum in het caudale deel te verwijderen, terwijl u het centrale deel van de hersenen met beide laterale ventrikels behoudt (Figuur 1B). Verdeel de hersenen langs de longitudinale spleet in twee hemisferen en ga dan verder met dissectie van beide hemisferen afzonderlijk (Figuur 1C). Werk met één halfrond en heroriënteer het zodat het mediale gebied naar boven wijst. Open de hersenen langs de lijn van het corpus callosum en scheid de cortex en het striatum van de hippocampus, het septum en het diencephalon, waardoor de laterale ventrikels bloot komen te liggen (Figuur 1D).OPMERKING: De SVZ bevindt zich tussen de holte van het ventrikel en het striatum, dus de volgende stappen zijn erop gericht de SVZ zo nauwkeurig mogelijk te isoleren van het omliggende weefsel. Verwijder de hippocampus, het septum en het diencephalon volgens de ventrale limiet van de ventrikels (Figuur 1E,F), het weefsel voorbij de rostrale en caudale uiteinden van de SVZ (Figuur 1G) en de cortex volgens het corpus callosum (Figuur 1H,I). Kantel het weefsel zodat de SVZ zijwaarts wijst (Figuur 1J), zodat het striatale weefsel onder de SVZ kan worden verwijderd (Figuur 1K) om een dun stukje weefsel te verkrijgen dat de NSC’s bevat (Figuur 1L). Bewaar beide ontlede SVZ’s van dezelfde muis in een plaat met 12 putjes met koude, steriele DPBS totdat de weefselverwerking begint.OPMERKING: De dissectie van beide SVZ’s uit één brein duurt 10 minuten. Langere tijd kan de levensvatbaarheid van de cel beïnvloeden. Als een verhoogde opbrengst van de culturen nodig is, kunnen SVZ’s van meerdere muizen van dezelfde leeftijd, geslacht, genetische achtergrond en genotype worden samengevoegd. Isolatie en zaaien van NSC’sSnijd elke SVZ in 4-5 kleine stukjes om de desaggregatie van het weefsel te vergemakkelijken.OPMERKING: Vanaf deze stap moet de hele procedure onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap. Breng de gehakte SVZ’s over in een centrifugebuis van 15 ml met behulp van een steriele plastic pasteurpipet. Zorg ervoor dat er geen fragmenten in de plaat achterblijven. Laat het weefsel op de bodem van de buis bezinken en verwijder de resterende DPBS. Voeg 500 μL gefilterd papaïne-bevattend enzymatisch mengsel per brein (2 SVZ’s) toe en incubeer de buisjes in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 min. Voeg na de incubatie aan elk monster 5 ml controlemedium toe, voorverwarmd tot 37 °C. Centrifugeer de monsters bij 300 x g gedurende 5 minuten. Verwijder vervolgens het supernatans voorzichtig met behulp van een micropipet of een vacuümpomp. Voeg 1 ml controlemedium toe en desintegreer de pellet voorzichtig mechanisch, pipetteren 10x tot 20x op en neer, met behulp van een vuurgepolijste Pasteur glazen pipet tot een homogene celsuspensie is verkregen.LET OP: Dit is een van de meest kritieke stappen in het protocol, omdat overmatige of onvoldoende uitsplitsing een negatieve invloed heeft op de opbrengst van de culturen. Voeg 4 ml controlemedium toe en meng door inversie om de cellen te wassen. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder vervolgens het supernatant. Voeg 1 ml compleet medium toe en resuspendeer de pellet door 10x op en neer te pipetteren om de celsuspensie te homogeniseren. Tel de celsuspensie met behulp van een Neubauer-kamer onder de microscoop na het verdunnen van 1/2 aliquot van de celsuspensie met trypanblauw of gebruik een automatische celteller. Zorg ervoor dat culturen worden uitgesplitst op het niveau van een enkele cel. Zodra de celsuspensie is bereid, zaait u de verkregen cellen gelijkmatig in 8 putjes van een plaat met 48 putjes in een eindvolume van 500 μl volledig medium.OPMERKING: We verkrijgen meestal 20.000 cellen uit twee SVZ’s, wat resulteert in een uiteindelijke zaaidichtheid van ongeveer 2.500 cellen/ml om de maximale opbrengst in culturen te bereiken. Vorming van neurosferenIncubeer cellen gedurende 5 tot 7 dagen in vitro (DIV) in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 . Onder deze omstandigheden sterven gedifferentieerde cellen af, terwijl NSC’s en voorlopercellen zich vermenigvuldigen als reactie op mitogene stimulatie, waardoor klonale aggregaten worden gevormd die worden erkend als primaire neurosferen.OPMERKING: EGF of bFGF kan worden gebruikt om de vorming van neurosferen te induceren. Deze twee groeifactoren zijn echter niet volledig vervangbaar. Controleer de grootte van de neurosferen met behulp van een omgekeerde microscoopgekoppelde camera, en zodra de neurosferen een groottebereik van 50 tot 100 μm bereiken, telt u alle primaire neurosferen die in de put zijn gevormd bij een vergroting van 10x. Het totale aantal gevormde primaire neurosferen dient als een schatting van het aantal NSC’s dat aanwezig is in de SVZ-niche. Verzamel na een periode van 10 dagen het kweekmedium uit elk putje om te beginnen met passeren. Voer vervolgens passaging uit na 5 tot 7 DIV, hoewel het vermeldenswaard is dat primaire bollen een iets langere duur nodig kunnen hebben om de ideale grootte voor subcultuur te bereiken (ongeveer 100 μm). Tabel 1: Oplossingen voor cultuurmedia. Het recept van het controlemedium wordt beschreven. Er wordt een voorgemengde hormoonmixoplossing gemaakt. Voorraad hormoonoplossingen kunnen van tevoren worden bereid zoals aangegeven en bewaard bij -20 °C. Vul het controlemedium vóór de celkweek aan met EGF en bFGF om het volledige medium te bereiden. Voor elk onderdeel worden opslagspecificaties, voorraden en werkconcentraties verstrekt. Klik hier om deze tabel te downloaden. 2. Uitbreiding van neurosfeerculturen Doorgang van neurosferenVerzamel het medium met de neurosferen van de multiwell-platen en breng ze over in een centrifugebuis van 15 ml. Zorg voor het herstel van zoveel mogelijk cellen door de putjes te spoelen met een paar milliliter DPBS. Centrifugeer neurosferen gedurende 5 minuten op 300 x g. Verwijder vervolgens het supernatant. Voeg 200 μL enzymatische oplossing (zie Materiaaltabel) toe aan de pellet en tik zachtjes op de bodem van de buis om deze los te maken. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de dissociatie van de neurosferen te vergemakkelijken. Voeg 1 ml controlemedium toe om de enzymatische reactie te stoppen en dissocieer de neurosferen mechanisch met een P1000-micropipet door 10x tot 20x op en neer te pipetteren. Voeg een extra volume van 4 ml van het controlemedium toe en meng door inversie om de cellen te wassen. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g. Verwijder vervolgens het supernatant. Voeg 1 ml volledig medium toe en resuspendeer de pellet om de cellulaire suspensie te homogeniseren door 10x op en neer te pipetteren.OPMERKING: Als het oorspronkelijke aantal en de grootte van de neurosferen te hoog zijn, voeg dan meer compleet medium toe om de celsuspensie te verdunnen en een betrouwbaar celgetal te garanderen. Tel de celsuspensie met behulp van een Neubauer-kamer na verdunning van 1/2 aliquot van de celsuspensie met trypanblauw of gebruik een automatische celteller. Om de celcultuur uit te breiden, zaait u cellen met een dichtheid van 10.000 cellen/cm2 met behulp van volledig medium in een geschikte kweekplaat of kolf (zie tabel 2). Incubeer cellen voor 5 tot 7 DIV in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor elke passage.OPMERKING: Neurosfeerculturen kunnen consequent worden uitgebreid en gepropageerd door herhaalde subculturisering, niet meer dan 10 passages, zonder hun proliferatiecapaciteiten te veranderen. EGF of bFGF kan worden gebruikt voor de teelt; Uitbreiding van de culturen op lange termijn kan echter alleen worden bereikt in aanwezigheid van EFG. ZelfvernieuwingstestNa het passeren van neurosfeerculturen, plakt u 1.000 individuele cellen in een plaat met 96 putjes, en voltooit u tot een eindvolume van 200 μL met volledig medium, wat resulteert in een uiteindelijke celdichtheid van de culturen van 5 cellen/μL.OPMERKING: Het aantal cellen dat wordt gezaaid, moet zo nauwkeurig mogelijk zijn. Bereid indien nodig tussenverdunningen voor om een betrouwbaar volume aan celsuspensie te garanderen voordat u gaat plateren. Bovendien wordt aanbevolen om 4 tot 5 replicaten per conditie te plaatsen om de technische variabiliteit te verminderen. Incubeer cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 5 dagen of totdat de neurosferen een voldoende grootte hebben bereikt (60 tot 100 μm). Vermijd het verplaatsen of schudden van de multiwell-plaat om aggregatie van de neurosfeer te voorkomen. Tel na de vorming van de neurosfeer het aantal neurosferen dat in elke put is gevormd met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop die is uitgerust met een bevestigde camera. De zelfvernieuwingstest kan worden uitgevoerd met EGF of bFGF afzonderlijk. Cryopreservatie van NSC-culturenOPMERKING: Neurosfeerculturen kunnen worden gecryopreserveerd voor toekomstig gebruik, waardoor het aantal benodigde muizen tot een minimum wordt beperkt. We raden aan om cellen te bewaren tot passage 10.Om cellen te cryoconserveren, brengt u 1 ml van de celsuspensie in volledig medium over naar een correct geëtiketteerde cryobuis. Voeg dimethylsulfoxide (DMSO) in een eindconcentratie van 10% toe aan de celsuspensie en meng voorzichtig door de buisjes om te keren.OPMERKING: DMSO dient als cryoprotecticum, maar kan giftig zijn voor cellen, dus deze stap moet snel worden uitgevoerd. Plaats de buizen in een vriezer van -80 °C met behulp van een vriescontainer die een geleidelijke temperatuurdaling van 1 °C/min mogelijk maakt. Dit geleidelijke bevriezingsproces voorkomt celbeschadiging door de vorming van ijskristallen tijdens cryopreservatie. Voor langdurige opslag houdt u de buizen in een tank met vloeibare stikstof bij -196 °C. Ontdooien van NSC-culturenOPMERKING: Indien nodig kunnen cellen worden ontdooid en culturen opnieuw worden geëxpandeerd voor experimenten.Haal de cryobuisjes met bevroren NSC’s uit de opslagtank voor vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C tot ze volledig ontdooid zijn, ongeveer 5 minuten.LET OP: Het is van cruciaal belang om de badtijd tot een minimum te beperken, aangezien DMSO giftig is en de levensvatbaarheid van de cellen kan beïnvloeden. Breng ontdooide cellen snel over in een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml voorverwarmd controlemedium. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g en verwijder het supernatant. Voeg 1 ml compleet medium toe en resuspendeer de pellet door 10x voorzichtig op en neer te pipetteren om de cellulaire suspensie te homogeniseren voordat deze wordt gezaaid.OPMERKING: Ontdooien kan de levensvatbaarheid van de cel beïnvloeden; Daarom wordt aanbevolen om cellen minstens één keer te passeren voordat ze worden gezaaid voor nieuwe experimenten. Mycoplasma testenOPMERKING: Mycoplasma-besmetting kan de gezondheid van de cellen in gevaar brengen, waardoor de groeisnelheid wordt beïnvloed. Daarom is mycoplasma-testen cruciaal om de integriteit en betrouwbaarheid van experimenten te waarborgen.DNA-extractieVerzamel minimaal 100 μL van de celcultuur voor DNA-extractie. Zowel supernatans als celpellet kunnen worden gebruikt voor DNA-extractie. Bewaar dit aliquot bij -20 °C tot extractie. Prik het deksel van de buis in en kook de aliquot op 99 °C gedurende 15 minuten met behulp van een thermoblok.OPMERKING: Het doorboren van de buisdeksels voorkomt dat de buizen openen tijdens het koken bij hoge temperaturen. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 16.900 x g. Breng het supernatans met het DNA over in een nieuw buisje. Bewaar het buisje met het DNA bij -20 °C tot PCR-testen. PCR voor Mycoplasma-detectieBereid het PCR-mengsel met de volgende componenten: 8,9 μl nucleasevrij water, 3 μl 5x reactiebuffer, 1,2 μl 25 mM MgCl2, 0,25 μl 2,5 mM dNTP’s, 0,15 μl Taq-polymerase en 0,25 μl van elke mycoplasma-specifieke primer in een concentratie van 10 μM (Forward, Fw: 5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ en Reverse, Rv: 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3″). Voeg 1 μL genoom-geëxtraheerd DNA toe. Bereid de PCR-mix voor in een laminaire stromingskap om DNA-besmetting te voorkomen. Incubeer de reactie in een thermische cycler als volgt: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, gloeien bij 53 °C gedurende 1 minuut, extensie bij 72 °C gedurende 30 s en een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min. Om de grootte van de resulterende band (ongeveer 500 bp) te bepalen, laadt u 15 μL van het DNA PCR-product gemengd met 3 μL 6x laadoplossing op een 2% agarosegel en voert u de elektroforese gedurende 40 tot 50 minuten uit op 100 V. Tabel 2 : Platen en kolven die voor de teelt worden gebruikt. De afmetingen en volumes van de meest gebruikte zaaiplaten en kolven zijn vermeld. De tabel bevat de diameter, het groeigebied en het gemiddelde volume dat voor elk vat wordt gebruikt, samen met een voorbeeld van het aantal NSC’s dat moet worden gezaaid onder expansieomstandigheden (10.000 cellen/cm2). Klik hier om deze tabel te downloaden. 3. Nucleofectie van neurosfeerculturen Bereiding van reagentiaDNA-preparaatBereid 25 μL competente E. coli DH5α-cellen voor in een buisje van 1,5 ml voor transformatie. Voeg 1 μL van het betreffende plasmide (in een verhouding van 100 tot 200 ng/μL) toe aan de cellen en onderwerpt ze gedurende 45 s aan een thermische schok bij 42 °C. Hier wordt een plasmide gebruikt met een korte haarspeld (sh)RNA voor het uitschakelen van Snrpn-expressie en een controleplasmide shSCRAMBLE.OPMERKING: Houd competente cellen gedurende de hele procedure op het ijs om de effectiviteit van de transformatie te behouden. Bekleed de getransformeerde cellen op LB-agarplaten met het juiste antibioticum en incubeer ze gedurende 18 uur bij 37 °C. Houd de petrischaaltjes omgekeerd om druppelvorming door condensatie te voorkomen, die bacteriekolonies zou kunnen verstoren.OPMERKING: Voeg geschikte antibiotica toe aan het LB-kweekmedium om uitsluitend de groei van getransformeerde bacteriën mogelijk te maken. Pak met een steriele pipetpunt individuele bacteriekolonies en breng ze over in een erlenmeyer die eerder is gevuld met 250 ml LB om een vloeibare cultuur te starten. Vermijd het kiezen van kleine satellietkolonies die rond de grotere doelkolonies zijn geplaatst, omdat deze mogelijk niet het gewenste plasmide hebben opgenomen. Incubeer de kolf terwijl u deze ‘s nachts krachtig schudt op een orbitale schudder bij 37 °C. Gebruik een endotoxinevrije maxiprep-kit en extraheer puur plasmide-DNA uit de bacterieculturen volgens de instructies van de fabrikant. Reconstitueer het DNA in de juiste hoeveelheid endotoxinevrij water om een plasmideconcentratie van 1 tot 2 μg/μl te verkrijgen.LET OP: De maximale opbrengst is afhankelijk van de groei van de cultuur. Gewoonlijk zal het resuspenderen van de plasmide-DNA-pellet in een volume van 200 μL resulteren in de gewenste DNA-concentratie. Bewaar het buisje met het plasmide-DNA bij -20 °C tot gebruik. Bereid een buisje van 1,5 ml voor met een eindvolume van 5 μl dat 2 tot 6 μg van het plasmide-DNA bevat dat bedoeld is voor nucleofectie. Voorbereiding van het materiaalBereid de nucleofectie-oplossing voor. Als u de aanbevolen kit gebruikt (zie Materiaaltabel), bereid dan 95 μl van de nucleofectieoplossing in een buisje van 1,5 ml voor elke gewenste nucleofectie. Pipetten en cuvetten zijn meestal inbegrepen in de set. Bereid er een van elk voor op elke nucleofectietoestand. Bereid een T25-kolf gevuld met 4 ml voorverwarmd compleet medium per toestand voor en bewaar deze in de broedmachine tot gebruik. Nucleofectie van NSC’sGebruik 1 tot 2 x 106 individuele cellen per conditie voor beoordeling. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder vervolgens het supernatant. Voeg 1 ml DPBS toe en resuspendeer de pellet door 10x op en neer te pipetteren om een homogene cellulaire suspensie te garanderen. Herhaal de centrifugatie (stap 2.1.6) voor een tweede wasbeurt en suspendeer de pellet ten slotte opnieuw in 95 μl nucleofectieoplossing.OPMERKING: Wasstappen zijn cruciaal om antibiotica uit het controlemedium te verwijderen en een effectieve nucleofectie te garanderen. Combineer de 95 μL cellen met een voorgemengde oplossing die 5 μL bevat van elk plasmide (2 μg totaal) dat is geselecteerd voor nucleofectie. Breng deze oplossing met behulp van een P200-micropipet over in een cuvet en plaats deze in het nucleofectorapparaat. Nucleofecteer de cellen met de gewenste plasmiden met behulp van het geoptimaliseerde NSC-programma van het nucleofectorsysteem. Breng na voltooiing van de elektroporatie voorzichtig warm, compleet medium in de cuvet met behulp van de Pasteurpipetten die in de set zitten. Breng vervolgens de inhoud van de cuvet over in een eerder bereide T25-kolf met voorverwarmd volledig medium. Na elektroporatie kan er sprake zijn van celdood, DNA-precipitatie en de vorming van een stroperig aggregaat. Breng dit niet over naar de T25-kolf, omdat dit de overleving van de cellen kan verminderen.OPMERKING: Deze stap is cruciaal en moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om een hoge opbrengst van nucleofectie en daaropvolgende overleving van de cultuur te garanderen. Incubeer nucleofecte cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 3 tot 5 dagen. Selectie van nucleofecte cellenStrategie A: Selectie van flowcytometrie door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)Na 3 tot 5 dagen nucleofectie passeert u de nucleofectieculturen volgens stap 2.1 en verzamelt u alle verkregen geïndividualiseerde cellen. Filtreer monsters door een celzeef van 40 μm om celaggregaten te verwijderen en analyseer ze met de flowcytometer van de celsorteerder.OPMERKING: Het is van cruciaal belang om in elke aandoening hetzelfde aantal cellen te sorteren om vergelijkende resultaten te verkrijgen. Met behulp van de software van de cytometer worden levende cellen gegate op basis van twee metingen: voorwaarts verstrooid licht (FSC-A) dat overeenkomt met celgrootte en zijwaarts verstrooid licht (SSC-A) dat overeenkomt met intracellulaire complexiteit. Selecteer de populatie van levende cellen die worden gekenmerkt door een hoog FSC-A-gehalte en een hoog SSC-A-gehalte.OPMERKING: Voeg eventueel 0,1 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe aan de celsuspensie voordat u het sorteert. Dit maakt het mogelijk om dode cellen en apoptotische lichamen uit de gating weg te gooien. Gooi cellolletten en drielingen weg door FSC-A- versus FSC-H-parameters uit te zetten. Kies de gebeurtenissen die zijn opgenomen in de diagonaal van de plot, die singlets vertegenwoordigen.OPMERKING: Wanneer cellen door de laser gaan, detecteert de cytometer spanningsveranderingen in de loop van de tijd. FSC-A staat voor het signaalgebied en FSC-H voor de piekhoogte. Singlets tonen een evenredige relatie tussen FSC-A en FSC-H (gelegen op de diagonaal van de grafiek), terwijl celaggregaten een grotere FSC-A vertonen ten opzichte van FSC-H vanwege een langer signaal. Selecteer nucleofecte cellen op basis van de fluorescentie-intensiteit van het reporter-gen gecodeerd door het gebruikte plasmide. Bij gebruik van GFP+ kunnen cellen bijvoorbeeld worden geselecteerd op basis van FITC-A-fluorescentieniveaus versus SSC-A-plot. Isoleer het gewenste aantal doelcellen voor elke aandoening en verzamel ze direct in een verzamelbuis gevuld met volledig medium. Zaad nucleofecteerde NSC’s met een dichtheid van 10.000 cellen/cm2. Incubeer de gesorteerde celculturen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Strategie B: Selectie op basis van antibioticaresistentie gecodeerd in het plasmideVoeg na 48 uur nucleofectie de juiste antibioticaconcentratie toe om resistente cellen te selecteren.OPMERKING: Voordat u begint, wordt aanbevolen om meerdere concentraties van het antibioticum te testen op niet-nucleofectieve cellen. De optimale antibioticaconcentratie is de laagste hoeveelheid waarbij alle niet-resistente cellen worden geëlimineerd. Zo bepaalden we een optimale concentratie van 4 μg/ml antibioticum blasticidine voor NSC-culturen. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur. Na 48 uur behandeling met antibiotica, subcultuur de nucleofecte cellen volgens stap 2.1. Als de neurosferen klein blijven, verwijder dan het antibioticum uit het kweekmedium door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen en kweek ze in een kolf met uitsluitend volledig medium. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator tot ze volgens stap 2.1 kunnen worden geëxpandeerd.

Representative Results

Optimale kweekomstandigheden maken isolatie en expansie van volwassen SVZ-afgeleide NSC’s in vitro mogelijkCulturen van NSC’s afgeleid van de volwassen SVZ hebben gediend als een waardevolle in vitro methode voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen en nichesignalen die NSC’s reguleren binnen hun specifieke micro-omgevingen. De neurosfeertest die in dit manuscript wordt beschreven, werd gebruikt om het NSC-aantal binnen de volwassen SVZ te onderzoeken. SVZ-weefsel werd geïsoleerd uit de hersenen van 3 maanden oude muizen, gedissocieerd en gekweekt in volledig NSC-medium aangevuld met zowel EGF als bFGF of elk afzonderlijk. Na 10 dagen in vitro (DIV) werd het totale aantal primaire bollen gevormd onder deze drie verschillende kweekomstandigheden gekwantificeerd met behulp van fasecontrastmicroscopie (Figuur 2A,B). Opmerkelijk genoeg tonen onze bevindingen aan dat de aanwezigheid van EGF leidde tot maximale vorming van primaire bollen, wat blijkt uit het verminderde aantal primaire bollen dat wordt waargenomen in culturen met alleen bFGF (Figuur 2A,B). Om het zelfvernieuwingsvermogen van NSC’s onder verschillende mediumomstandigheden te evalueren, werden cellen gesubcultiveerd en geplateerd met een lage dichtheid (5 cellen/μL) in media aangevuld met de eerder genoemde combinaties van mitogenen. Uit kwantificering van secundaire bollen bleek dat SVZ-NSC’s ten minste EGF nodig hebben om zichzelf efficiënt te vernieuwen en dat de combinatie van zowel EGF als bFGF het zelfvernieuwend vermogen van cellen verbetert (Figuur 2B). Bovendien werd voor een gedetailleerde analyse van de groeidynamiek in verschillende mediaomstandigheden het aantal gezaaide en verkregen cellen gedurende 7 passages geregistreerd. Groeicurven verkregen uit verschillende mediacondities bevestigden dat culturen die alleen of in combinatie met bFGF waren gesupplementeerd, een verbeterde groeidynamiek vertoonden in vergelijking met culturen die alleen met bFGF waren aangevuld (figuur 2C). Gezamenlijk onderbouwen deze bevindingen dat gelijktijdig gebruik van zowel EGF als bFGF de NSC-kweekopbrengst in vitro verbetert. Om het NSC-aantal binnen de SVZ over verschillende postnatale leeftijden te onderzoeken en de impact van veroudering van muizen op de efficiëntie van neurosfeerkweek te evalueren, werd SVZ-weefsel van muizen van 1 maand tot 12 maanden oud ontleed. Onze bevindingen onthulden met name een significante afname van het aantal primaire bollen met toenemende leeftijd, wat een maximale efficiëntie in het aantal bollen aantoont op een leeftijd van ongeveer 2 tot 4 maanden (Figuur 2D). Om het zelfvernieuwingsvermogen van NSC’s tijdens subcultuur te evalueren, werden NSC’s van muizen van 2 tot 4 maanden oud bovendien gesubcultiveerd en gezaaid met klonale dichtheid (5 cellen/μL) in volledig medium. Kwantificering van het aantal secundaire bollen in de daaropvolgende passages wees op een aanzienlijke afname van de cultuurefficiëntie ten opzichte van passages (figuur 2E). Op basis van al deze observaties wordt aanbevolen om zelfvernieuwingstesten uit te voeren tijdens vroege passages om de NSC-kweekomstandigheden verder te optimaliseren. Nucleofectie is een zeer efficiënte techniek voor het manipuleren van genexpressie in volwassen NSC’sGezien het feit dat NSC’s niet gemakkelijk transfecteerbaar zijn om genexpressie te manipuleren, presenteren we hier een protocol van nucleofectie met een hogere mate van succesvolle genafgifte zonder de noodzaak om virale transductie te gebruiken. Na dissectie en kweek van individuele SVZ’s van muizen van 2 tot 4 maanden oud, werden NSC’s nucleofected met een GFP-dragend plasmide zoals beschreven (Figuur 3A). Detectie van GFP-positieve cellen 2 dagen na nucleofectie toonde een efficiëntie variërend van 30% tot 50%, in overeenstemming met eerdere literatuur28. Om specifiek succesvol genucleofecteerde NSC’s te isoleren, werden cellen gesorteerd op FACS op basis van GFP-fluorescentie-intensiteit 3 tot 5 dagen na nucleofectie (Figuur 3A-C). Ongeveer 40% van de pre-FACS-geanalyseerde cellen vertoonden hoge GFP-fluorescentieniveaus en werden vervolgens geselecteerd door sortering (Figuur 3C). Het opnieuw inzaaien van gesorteerde GFP+ NSC’s toonde aan dat alle cellen GFP-positief waren, wat de op nucleofectie gebaseerde celisolatiemethode valideerde (Figuur 3D). Met name nucleofected NSC’s behielden de levensvatbaarheid door daaropvolgende passages, wat de haalbaarheid van nucleofectie voor volwassen NSC’s bevestigt. Deze resultaten benadrukken de effectiviteit van het combineren van nucleofectie en FACS om een zuivere cultuur van gemodificeerde NSC’s tot stand te brengen. Als voorbeeld van genmodulatie in volwassen NSC’s werd genverzwakking via korte haarspeld (sh) RNA-nucleofectie gebruikt. In het bijzonder werd een shRNA gericht op het kleine nucleaire ribonucleoproteïne polypeptide N (Snrpn)-gen, dat een CAG-GFP-reporter (shSNRPN) draagt, nucleofecteerd in NSC-culturen afgeleid van 2 maanden oude muizen. Downregulatie van Snrpn werd bevestigd door qPCR en immunocytochemie in cellen met een nucleofectie met het shSNRPN-plasmide, maar niet voor het controle-shSCRAMBLE-plasmide (Figuur 3E,F)29. Om de effecten van Snrpn-downregulatie op het zelfvernieuwingsvermogen van NSC op te helderen, werd een test met lage dichtheid uitgevoerd in cellen met nucleofectie (Figuur 3F,G). Kwantificering van secundaire neurosferen in nucleofecte culturen onthulde een verhoogde neurosfeervormingscapaciteit bij neerwaartse regulatie van Snrpn (Figuur 3G). Deze test onderstreept het nucleofectievermogen om genexpressie in volwassen NSC’s te manipuleren en, meer specifiek, identificeert de rol van Snrpn bij het handhaven van stamheid in volwassen NSC’s. Figuur 1: Gedetailleerde beschrijving van SVZ-dissectie. (A) Na verwijdering van het muizenbrein wordt het gehele brein met DPBS overgebracht naar een siliconen kussentje voor dissectie. (B) OB en cerebellum worden met een scalpel uit de hersenen verwijderd. (C) De hersenen zijn verdeeld in twee hemisferen om afzonderlijk door te gaan met dissectie. (D) De hersenen worden geopend langs de lijn van het corpus callosum, waardoor de cortex en het striatum worden gescheiden van de hippocampus, het septum en het diencephalon, waardoor de laterale ventrikels bloot komen te liggen. (E-F) De hippocampus, het septum en het diencephalon worden verwijderd volgens de ventrale limiet van de ventrikels. (G-I) Het weefsel voorbij de rostrale en caudale uiteinden van de SVZ en de cortex wordt verwijderd volgens het corpus callosum. (J-K) Het weefsel wordt gekanteld zodat de SVZ zijwaarts wijst, waardoor het striatale weefsel onder de SVZ kan worden verwijderd. (L) Er wordt een dun stukje weefsel verkregen dat de SVZ bevat. Zwarte stippellijnen geven de snijplaats aan. Zwarte stippellijnen geven bij elke stap de locatie van de SVZ aan. Afkortingen: OB = bulbus olfactorius; CB = cerebellum. Schaalbalk in A-H: 5 mm; in I-L: 3 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Zowel mitogenen EGF als bFGF zijn nodig voor een optimale kweek en uitbreiding van NSC’s in vitro. (A) Fasecontrastmicroscopiebeelden van primaire en secundaire neurosfeerculturen in NSC-medium aangevuld met zowel EGF als bFGF of elk mitogeen afzonderlijk. (B) Aantal primaire bollen verkregen per muis en per putje op basis van de mitogeensamenstelling van het kweekmedium: geen mitogenen (grijs, n=9), EGF+bFGF (blauw, n=33), alleen EGF (groen, n=20), of alleen bFGF (roze, n=19; linkerpaneel). Aantal secundaire neurosferen gevormd met een lage dichtheid (5 cellen/μL) per putje op basis van de mitogeensamenstelling van het kweekmedium: geen mitogenen (grijs, n=11), bFGF (roze, n=18), EGF (groen, n=18) of EGF+bFGF (blauw, n=37; rechterpaneel). De Kruskal-Wallis-test met de post-hocanalyse van Dunn werd gebruikt. (C) Groeicurven die het totale aantal cellen weergeven dat is gevormd na 8 passages in verschillende neurosfeerculturen volgens de mitogenen die aanwezig zijn in het kweekmedium: bFGF (roze, n=5), EGF (groen, n=5) of EGF+bFGF (blauw, n=10). Er werd gebruik gemaakt van lineaire regressieanalyse. (D) Het aantal primaire neurosferen afgeleid van individuele muizen, ontleed en uitgesplitst van dieren in verschillende postnatale ontwikkelingsstadia. Er werd gebruik gemaakt van lineaire regressieanalyse. n aangegeven tussen haakjes. (E) Het aantal secundaire neurosferen gevormd met een lage dichtheid (5 cellen/μL) door daaropvolgende passages in vitro om hun zelfvernieuwend vermogen te beoordelen. De Kruskal-Wallis-test werd gebruikt en p-waarden zijn opgenomen: *: p<0,05; **: blz<0,01; : blz<0,001; : blz<0,0001. N.S: Niet significant. Foutbalken vertegenwoordigen de SEM. Schaalbalk in A is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Schema van het nucleofectieproces en FACS-gebaseerde celselectie van nucleofectiecellen. (A) Overzicht van het nucleofectieproces en FACS-gebaseerde celselectie van nucleofectiecellen. 1) Plasmide-DNA-oplossing wordt gecombineerd met de nucleofectie-oplossing en aan de cellen toegevoegd. Dit mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een cuvet voor nucleofectie. 2) De cuvet met DNA en cellen wordt in de nucleofector ingebracht, waar een elektrische schok wordt toegepast. Voor neurosfeerculturen geïsoleerd uit de volwassen SVZ, raden we aan om het A-031 NSC-programma te gebruiken. 3) Na nucleofectie worden de cellen overgebracht naar een kolf met volledig medium aangevuld met EGF en bFGF. 4) Cellen worden gesorteerd op FACS op basis van de expressie van de verslaggever in het plasmide-DNA. 5) Gesorteerde cellen ondergaan verdere kweek voor volgende experimenten. (B) Op FACS gebaseerde selectiestrategie en gating voor nucleofected NSC’s. Eerst worden levende cellen geselecteerd op basis van hoge FSC-A en hoge SSC-A (linker grafiek), en vervolgens worden celdoubletten en tripletten geëlimineerd door FSC-A versus FSC-H parameters te analyseren (rechter grafiek). (C) FACS-gating voor nucleofecte cellen op basis van hun GFP-expressie (SSC-A versus FITC-A-fluorescentie). (D) Fasecontrastmicroscopie en GFP-fluorescentiebeelden van nucleofected NSC’s vóór (n=3) en na (n=4) FACS-selectie (linkerpaneel). Het percentage nucleofecte GFP+- cellen wordt weergegeven voor en na FACS-selectie (rechterpaneel). Er is gebruik gemaakt van de T-toets. (E) Kwantitatieve PCR (qPCR) analyse van Snrpn-expressie in prolifererende NSC’s met een nucleofect met Snrpn-specifiek shRNA (n=4). Nucleofectie met behulp van een shRNA SCRAMBLE diende als controle (n=4). Er is gebruik gemaakt van de T-toets. (F) Immunocytochemische beelden die SNRPN (in rood) weergeven in NSC’s 7 dagen na de shRNA-nucleofectie (buitenste panelen). DAPI werd gebruikt om DNA-vlekken tegen te gaan. Representatieve afbeeldingen van neurosferen afgeleid van NSC’s onder shSNRPN- en shSCRAMBLE-omstandigheden (middelste panelen). (G) Kwantificering van het aantal neurosferen gevormd in NSC-culturen na nucleofectie met shSNRPN (n=8) of shSCRAMBLE (n=8). Er is gebruik gemaakt van de T-toets. P-waarden zijn inbegrepen: *: p<0,05; **: blz<0,01; : blz<0,001; : blz<0,0001. N.S: Niet significant. Foutbalken vertegenwoordigen de SEM. Schaalbalk in D, 10 μm; in F, 100 μm (sterk vergrote beelden in F, 7 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Vanwege het ontbreken van definitieve markers voor het identificeren van de NSC-populatie in vivo, is de analyse van NSC’s voornamelijk gebaseerd op het observeren van het gedrag van cellen geïsoleerd uit neurogene niches in ex vivo-omstandigheden . Baanbrekend werk van Reynolds en Weiss legde de basis door nauwkeurige kweekomstandigheden vast te stellen, waardoor individuele cellen uit jongvolwassen (2 maanden oud) SVZ-muizenweefsel konden worden geïsoleerd en uitgebreid onder niet-adhesieve omstandigheden. Deze cellen worden meestal vermeerderd in een serumvrij medium dat EGF en bFGF bevat, aandoeningen die differentiatie in neuronen en glia volledig voorkomen en tegelijkertijd proliferatie bevorderen. Inderdaad, onder deze kweekomstandigheden9 sterven de meeste cellen tijdens de eerste dagen in de kweek, maar een kleine subset begint zich te delen en vormt voornamelijk zwevende neurosferen9. Enzymatische dissociatie en subcultuur van deze celaggregaten vergemakkelijken de voortplanting van culturen, wat het zelfvernieuwende vermogen van deze culturen aantoont.

Met name neurosfeerculturen vertonen uitbreidingspotentieel met de toevoeging van alleen EGF, terwijl NSC’s gekweekt in een medium dat alleen bFGF bevat, geen celproliferatie op lange termijn vertonen30. Beide bewijsstukken wijzen op EGF als het primaire NSC-mitogeen voor zelfvernieuwing. Desalniettemin verbetert de aanwezigheid van zowel EGF als bFGF in het kweekmedium het zelfvernieuwingsvermogen van NSC’s31 en draagt het bij aan het balanceren van het differentiatiepotentieel in astrocyten, neuronen en oligodendrocyten 32,33,34,35. Bovendien zorgt het gebruik van een gedefinieerd mengsel van hormonen en factoren in plaats van commerciële alternatieven om het medium aan te vullen, voor de hoge kwaliteit en reproduceerbaarheid van NSC-culturen. Onder deze omstandigheden kunnen NSC-culturen van muizen blijven bestaan als stabiele cellijnen zonder onsterfelijkheid te ondergaan. Desalniettemin is een punt van zorg in neurosfeerculturen het potentieel van proliferatieve celpopulaties om genetische transformaties te ondergaan, waarbij de regulerende mechanismen van de celcyclus worden omzeild en wat leidt tot een onsterfelijk fenotype. Daarom, hoewel neurosfeerculturen zeer uitbreidbaar zijn, worden culturen voorbij 10 in vitro-passages meestal weggegooid voor studies, omdat ze replicatieve veroudering kunnen ondergaan en cellen met een abnormale chromosomale inhoud of onregelmatige groeidynamiek kunnen ontstaan. Bovendien moet het gebruik van langdurig gevestigde neurosfeerculturen continu worden gemonitord. Neurosfeerculturen bieden ook de mogelijkheid om hun kenmerken en potentieel te onderzoeken in een gecontroleerde omgeving, waardoor een nauwkeurigere en aanpasbare instelling ontstaat die nauwkeuriger kan worden gemoduleerd en gecontroleerd dan in vivo. Door middel van clonogene of populatieanalyses in vitro is het mogelijk om de zelfvernieuwings- en proliferatiecapaciteiten van deze cellen te kwantificeren, waardoor de onderliggende mechanismen die deze eigenschappen bepalen, gemakkelijker kunnen worden geïdentificeerd.

Ondanks de grote lijst met voordelen van het werken met NSC’s in vitro, vormen de aard van dit kweekprotocol en de delicatesse van NSC’s echter een uitdaging in het veld. Het aantal primaire neurosferen dat tijdens een typische dissectie wordt gegenereerd, kan bijvoorbeeld aanzienlijk variëren, afhankelijk van de vaardigheid en precisie van de experimentator. De resultaten van de primaire neurosfeer illustreren deze variabiliteit in het aantal primaire neurosferen verkregen uit de SVZ van muizen van 2 maanden oud, variërend tussen 500 en 3000 neurosferen. Verschillende factoren kunnen bijdragen aan deze variabiliteit. Ten eerste minimaliseert de precisie van de dissectie ongewenst parenchymaal weefsel, wat de vorming van primaire bollen remt. Ten tweede zorgt het genereren van kleine stukjes SVZ-weefsel voor een efficiënte enzymatische vertering en trituratie, waardoor celverlies wordt verminderd. Dit benadrukt de noodzaak van voldoende voorafgaande oefening van het dissectieprotocol en een verfijnde ontwikkeling van weefselverwerking tijdens de oprichting van de neurosfeerculturen.

Een andere beperking van deze culturen ligt in het feit dat neurosferen zowel NSC’s als voorlopercellen kunnen bevatten, waardoor het een uitdaging is om onderscheid te maken tussen deze twee populaties binnen primaire culturen. Hoewel van verschillende markers zoals GFAP, Nestin, Musashi en SOX2 is gemeld dat ze tot expressie worden gebracht door NSC’s8, is geen van deze uitsluitend geassocieerd met NSC’s. Opkomende FACS-technieken op basis van antigeenexpressie op het celoppervlak hebben de isolatie van NSC’s en hun nageslacht mogelijk gemaakt. Deze studies hebben aangetoond dat transit-amplificerende voorlopercellen niet in staat zijn om neurosferen te vormen bij passage25,36. Dus, terwijl de relatie tussen SVZ-cellen en neurosfeer-initiërende cellen verdere verfijning vereist 18,19,20,21,22,23, kan het vermogen van neurosferen om gedurende een langere periode serieel te worden gepasseerd de aanwezigheid van NSC’s in de culturen weerspiegelen.

Dit neurosfeercultuursysteem heeft gediend als een robuust model voor het onderzoeken van de impact van signaalroutes en genexpressie op het handhaven van het zelfvernieuwingsvermogen van NSC in vitro15,29. Een benadering om deze aspecten te onderzoeken, is het transfecteren van NSC’s om specifieke genen tot overexpressie te brengen of neer te halen. Dit kan worden bereikt door middel van verschillende technieken, waaronder virale en niet-virale methoden. Hoewel virale vectoren vaak een hoge efficiëntie van genoverdracht bereiken, hebben ze belangrijke beperkingen, zoals de hoge veiligheidseisen en de tijdrovende vectorproductie26. Omgekeerd bereiken klassieke transfectiemethoden zoals lipofectie en elektroporatie zeer lage transfectiesnelheden, waardoor ze onhaalbaar zijn voor moeilijk te transfecteren cellen. De nucleofectietechnologie biedt een gebruiksvriendelijke aanpak door celtypespecifieke nucleofectieoplossingen te combineren met unieke elektrische parameters voor elk celtype37,38. Dit zorgt voor een directe overdracht van DNA in de celkern39, waardoor het DNA op een celcyclusonafhankelijke manier kan worden opgenomen. Bijgevolg komt nucleofectie naar voren als een levensvatbare techniek voor het transfecteren van moeilijk te transfecteren cellen zoals NSC’s van muizen28,40.

Een beperking van deze methode is dat een minimum van 2 x 106 cellen wordt aanbevolen en noodzakelijk is voor elke nucleofectie, hoewel in optimale omstandigheden een lager aantal cellen per enkele nucleofectie kan worden gebruikt (d.w.z. 5 ×10 5 cellen). Een ander nadeel van de methode is dat de kwaliteit en concentratie van DNA dat wordt gebruikt voor nucleofectie een aanzienlijke invloed hebben op de efficiëntie van genoverdracht. Het gebruik van endotoxinevrij bereid DNA wordt ten zeerste aanbevolen om verhoogde celsterfte als gevolg van de aanwezigheid van endotoxine te voorkomen. Bovendien kan het gebruik van meer dan 6 μg totaal DNA voor nucleofectie zowel de efficiëntie van de genoverdracht als de levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk verminderen. Ten slotte is de toediening van elektrische pulsen ook van cruciaal belang voor de overleving van nucleofecte cellen.

In dit werk hebben we de manipulatie van Snrpn-genexpressie geïllustreerd door een strategie toe te passen waarbij de expressie ervan wordt verlaagd met behulp van episomale plasmiden. Deze plasmiden zijn niet geïntegreerd in het genoom van de cellen, en aangezien NSC’s zich in vitro blijven vermenigvuldigen, zal het geïntroduceerde DNA vervolgens worden verdund tijdens de celdeling en zo het effect van genetische manipulatie verliezen. Daarom is deze strategie waardevol om het effect van een acute verandering in een korte periode of om cellen in vitro te laten geboorten. Er zijn enkele alternatieven beschikbaar om een langduriger effect van genverstoring te evalueren. Er zou bijvoorbeeld gebruik kunnen worden gemaakt van een integratief systeem zoals de op transposon gebaseerde piggyBAC. Dit systeem bestaat uit het introduceren van de gewenste coderende sequentie in het plasmide geflankeerd door transponeerbare sequenties en het co-nucleofect van de cellen met een plasmide dat de sequentie voor het enzym transposase41 bevat. Als alternatief kunnen transposons of de CRISPR/Cas-systemen worden gebruikt.

Verdere ontwikkeling van transfectingtechnologieën zal een belangrijke stap zijn in de richting van high-throughput assays om de rol van verschillende genen op de fysiologie van volwassen neurale stamcellen te beoordelen. In combinatie met steeds geavanceerdere zuiverings- en expansiemethoden zullen deze studies het mogelijk maken om de in vitro biologie van volwassen NSC’s te begrijpen en de biologische verschillen tussen zwevende neurosferen en NSC’s in vivo te vergelijken.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerio de Ciencia e Innovación en Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 en EUR2023-143479) naar SRF. EJV (FPU20/00795) en DSL (FPU22/03797) worden gefinancierd door het Spaanse Formación de Profesorado Universitario fellowship-programma (FPU). LLC (PRE2020-094137) en JDM (PREP2022-000680) worden gefinancierd door het Spaanse fellowship-programma Formación de Personal Investigador (FPI). CMM (CIACIF/2022/366) wordt gefinancierd door Generalitat Valenciana. MIL (CPI-22-481) wordt gefinancierd door Programa INVESTIGO fellowship (Next Generation EU). Open Access financiering door het Ministerio de Ciencia e Innovación.

Materials

0.22 μm pore-filter bottles (250 mL) VWR 514-0330P
0.22 μm pore-filter bottles (500 mL) VWR 514-0332P
12-well plate LabClinics PLC30012
15 mL tube Fisher 10738771
24-well plate LabClinics PLC30024
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) BioWest L0180-100
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9542
48-well plate ThermoFisher 150687
6-well plate LabClinics PLC30006
96-well plate Labclinics PLC30096
Accutase solution Sigma A6964-100ML Referred as enzymatic solution
Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector Kit Lonza VPG-1004
Amaxa Nucleofector Iib Lonza 10700807
Antibiotic/Antimitotic (A/A) Sigma A5955
Apo-t-Transferrine Sigma T2252-1G
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Sigma F0291
Blasticidin Sigma 203350
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma B4287-25MG
Cell strainer 40 μm LabClinics PLC93040
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) NZYTech MB08701
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418
Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) Gibco 14080-055
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1 Gibco 11320-074
E. coli DH5α Competent Cells ThermoFisher EC0112
Earles's Balanced Salt Solution (EBSS) Gibco 24010-043
Epidermal Growth Factor – Human recombinant (EGF) Gibco 53003-018
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E-6511
Fine Forceps Fine Science Tools 11274-20
Fine Scissors Sharp Fine Science Tools 14060-09
Glucose Sigma G-7021
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Kit includes reagents for PCR
Heparin Sigma H-3149
Insuline Sigma I6634
LB agar (Lennox) LabKem AGLB-00P-500
LB broth (Lennox) LabKem LBBR-00P-500
L-Cysteine Sigma C-8277
L-Glutamine Gibco 25030-024
Neubauer chamber Blaubrand BR718620
Nuclease free water Labbox WATR-00A-10K
NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit NZYTech MB39901
Papain Lyophilized Worthington LS003119
Progesterone Sigma P-6149
Putrescine Sigma P-7505
Scalpel Fine Science Tools 10316-14
shSCRAMBLE Mission (Sigma) SHC003
shSNRPN Mission (Sigma) TRCN0000109285
Sodium Selenite Sigma S-9133
Spatula Fine Science Tools 10090-17
Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter) Epica SFPE-22E-050
T12.5 cm2 Flask Biofil TCF012025
T25 cm2 Flask LabClinics PLC70025
T75 cm2 Flask LabClinics PLC70075
Tweezers Fine Science Tools 91150-20
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  2. Ming, G., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Ann Rev Neurosci. 28 (1), 223-250 (2005).
  3. Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
  4. Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
  5. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc Natl Acad Sci. 96 (20), 11619-11624 (1999).
  6. Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain. J Neurosci. 17 (13), 5046-5061 (1997).
  7. Mamber, C., Kozareva, D. A., Kamphuis, W., Hol, E. M. Shades of gray: The delineation of marker expression within the adult rodent subventricular zone. Prog Neurobiol. 111, 1-16 (2013).
  8. Cebrian-Silla, A., et al. Single-cell analysis of the ventricular-subventricular zone reveals signatures of dorsal and ventral adult neurogenesis. eLife. 10, e67436 (2021).
  9. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  10. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
  11. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  12. Ferrón, S. R., et al. Postnatal loss of Dlk1 imprinting in stem cells and niche astrocytes regulates neurogenesis. Nature. 475 (7356), 381-385 (2011).
  13. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: A review of the neurosphere assay. Anat Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  14. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), 156059 (2019).
  15. Ferrón, S. R., et al. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Prot. 2 (4), 849-859 (2007).
  16. Ferron, S., et al. Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells. Development. 131 (16), 4059-4070 (2004).
  17. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Meth. 3 (10), 801-806 (2006).
  18. Santa-Olalla, J., Baizabal, J., Fregoso, M., Cárdenas, M. D. C., Covarrubias, L. The in vivo positional identity gene expression code is not preserved in neural stem cells grown in culture. Eur J Neurosci. 18 (5), 1073-1084 (2003).
  19. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  20. Wan, F., et al. The utility and limitations of neurosphere assay, CD133 immunophenotyping and side population assay in Glioma stem cell research. Brain Pathol. 20 (5), 877-889 (2010).
  21. Deleyrolle, L. P., Rietze, R. L., Reynolds, B. A. The neurosphere assay, a method under scrutiny. Acta Neuropsych. 20 (1), 2-8 (2008).
  22. Campos, L. S. Neurospheres: Insights into neural stem cell biology. Neurosci Res. 78 (6), 761-769 (2004).
  23. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship. Nat Meth. 2 (5), 333-336 (2005).
  24. Parker, M. A. Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone. Exp Neurol. 194 (2), 320-332 (2005).
  25. Belenguer, G., et al. Adult neural stem cells are alerted by systemic inflammation through TNF-α receptor signaling. Cell Stem Cell. 28 (2), 285-299 (2021).
  26. Cruz, M. T. G., Simões, S., Lima, M. C. P. de Improving lipoplex-mediated gene transfer into C6 glioma cells and primary neurons. Exp Neurol. 187 (1), 65-75 (2004).
  27. Hagemann, C., et al. High efficiency transfection of glioma cell lines and primary cells for overexpression and RNAi experiments. J Neurosci Meth. 156 (12), 194-202 (2006).
  28. Moritz, S., Lehmann, S., Faissner, A., Holst, A. von An induction gene trap screen in neural stem cells reveals an instructive function of the niche and identifies the splicing regulator Sam68 as a Tenascin-C-regulated target gene. Stem Cells. 26 (9), 2321-2331 (2008).
  29. Montalbán-Loro, R., et al. TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn. Nat Comm. 10 (1), 1726 (2019).
  30. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. J Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).
  31. Nieto-Estévez, V., Pignatelli, J., Araúzo-Bravo, M. J., Hurtado-Chong, A., Vicario-Abejón, C. A global transcriptome analysis reveals molecular hallmarks of neural stem cell death, survival, and differentiation in response to partial FGF-2 and EGF deprivation. PLoS One. 8 (1), 53594 (2013).
  32. Vergaño-Vera, E., Méndez-Gómez, H. R., Hurtado-Chong, A., Cigudosa, J. C., Vicario-Abejón, C. Fibroblast growth factor-2 increases the expression of neurogenic genes and promotes the migration and differentiation of neurons derived from transplanted neural stem/progenitor cells. 神経科学. 162 (1), 39-54 (2009).
  33. Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40 (3), 485-499 (2003).
  34. Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M., Götz, M. Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6. Mol Cell Neurosci. 25 (4), 664-678 (2004).
  35. Bithell, A., Finch, S. E., Hornby, M. F., Williams, B. P. Fibroblast growth factor 2 maintains the neurogenic capacity of embryonic neural progenitor cells in vitro but changes their neuronal subtype specification. Stem Cells. 26 (6), 1565-1574 (2008).
  36. Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci. 106 (15), 6387-6392 (2009).
  37. Kobayashi, N., et al. Gene delivery to embryonic stem cells. Birth Def Res C. 75 (1), 10-18 (2005).
  38. Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Meth Mol Biol. 801, 65-74 (2011).
  39. Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J Immunol Meth. 284 (1-2), 133-140 (2004).
  40. von Holst, A., Egbers, U., Prochiantz, A., Faissner, A. Neural stem/progenitor cells express 20 tenascin C isoforms that are differentially regulated by Pax6. J Biol Chem. 282 (12), 9172-9181 (2007).
  41. Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trend Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).

タグ

Neural Stem CellsSubventricular ZoneNeurosphereNucleofectionGene DeliveryGene ExpressionGene PerturbationBasic Fibroblast Growth FactorEpidermal Growth Factor

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Jiménez-Villalba, E., Lázaro-Carot, L., Mateos-Martínez, C. M., Díaz-Moncho, J., Samper-Llavador, D., Igual-López, M., Planells, J., Ferrón, S. R. Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone. J. Vis. Exp. (208), e66651, doi:10.3791/66651 (2024).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image