来自成体小鼠脑室下区的神经干细胞的分离、扩增和成核转染

所有用动物进行的实验都事先得到了瓦伦西亚大学伦理委员会的批准，并得到了 Conselleria de Agricultura， Ganadería y Pesca， Generalitat Valenciana（西班牙）的授权。 1. 神经球的原代培养 试剂的制备在去离子水中制备 Dulbecco 磷酸盐水缓冲液 （DPBS） 的缓冲溶液，并通过高压灭菌进行灭菌。或者，通过在去离子水中加入 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4 溶液来制备 0.1 M PBS pH 7.4。 用预先冷却的 DPBS 填充两个 12 孔板并将它们保存在冰上：一个将用于在解剖前保存整个大脑，另一个将保存解剖的 SVZ 直到组织处理。 如下所述准备含木瓜蛋白酶的酶混合物。在 Earl 平衡盐溶液 （EBSS） 中制备 EDTA/L-半胱氨酸解离溶液，每种溶液的最终浓度为 0.2 mg/mL。为了实现完全溶解，请将试管置于 37 °C 的水浴中孵育。 将 12 U/mL 木瓜蛋白酶溶解在 EDTA/L-半胱氨酸溶液中。假设每个大脑将使用 500 μL 酶溶液。 将木瓜蛋白酶溶液在 37 °C 的水浴中加入约 20 分钟，直到酶完全溶解。 用注射器和 0.22 μm 孔径过滤器对酶混合物进行过滤灭菌，并将其保持在 4 °C 直至使用。注意：木瓜蛋白酶在 37 °C 下 30 分钟后被激活，并且可以在 4 °C 下储存 12 小时。 根据 表 1 添加激素混合物溶液来制备对照培养基，并使用硝酸纤维素 0.22 μm 孔径过滤器对其进行过滤灭菌。将培养基保持在 4 °C，并在使用前在 37 °C 的水浴中加热。 按照 表 1 使用前，通过在对照培养基中补充 EGF 和 bFGF 来制备完全培养基。不要过滤完全培养基，因为过滤时有丝分裂原会丢失。 脑提取和 SVZ 解剖注意：在安乐死之前，允许老鼠自由获取食物和水。使用8至16周龄的C57BL / 6小鼠。两性均使用，制备方法无明显差异。手术前通过高压灭菌对解剖工具进行消毒。然后，将手术刀、镊子、剪刀和抹刀浸入装有 70% 乙醇的烧杯中。用 70% 乙醇彻底清洁每个工作表面。 通过 CO2 过量处死小鼠并通过颈椎脱位确认。用 70% 乙醇喷洒头部，以尽量减少脑组织污染的可能性。 用剪刀将鼠标的头部与身体的其他部分分开。用小剪刀沿头尾轴切开颅骨上方的皮肤，直到颅骨完全露出。 首先用小剪刀沿着矢状缝线切开颅骨，然后用细镊子去除骨头，从而暴露大脑。在此步骤中，请注意不要对颅骨下方的脑组织造成任何损害。 使用刮刀小心地从颅骨中取出大脑，并将其放入含有冷 DPBS 的 12 孔板中。将板放在冰上，直到解剖完成。 将整个大脑转移到将进行解剖的硅垫上，并在大脑上滴几滴冷 DPBS（图 1A）。 使用手术刀去除位于大脑喙端的 OB 和位于尾部的小脑，同时保留包含两个侧脑室的大脑中央部分（图 1B）。 沿纵裂将大脑分成两个半球，然后分别解剖两个半球（图 1C）。 使用一个半球，重新调整方向，使内侧区域朝上。沿着胼胝体线打开大脑，将皮层和纹状体与海马体、隔膜和间脑分开，从而暴露出侧脑室（图 1D）。注意：SVZ 位于心室腔和纹状体之间，因此后续步骤旨在尽可能准确地将 SVZ 与周围组织隔离。 沿着脑室的腹侧界限去除海马体、隔膜和间脑（图 1E，F），去除 SVZ 喙端和尾端以外的组织（图 1G），以及遵循胼胝体的皮层（图 1H，I）。 倾斜组织，使 SVZ 面向侧面（图 1J），允许去除 SVZ 下方的纹状体组织（图 1K）以获得一块含有 NSC 的薄组织（图 1L）。 将来自同一只小鼠的两种解剖 SVZ 储存在含有冷、无菌 DPBS 的 12 孔板中，直到组织处理开始。注意：从一个大脑解剖两个 SVZ 需要 10 分钟。较长的时间可能会影响细胞活力。如果需要提高培养物的产量，可以合并来自相同年龄、性别、遗传背景和基因型的多只小鼠的 SVZ。 NSC 的分离和接种将每个 SVZ 切成 4-5 小块，以促进组织的解聚。注意：从此步骤开始，整个过程必须在无菌条件下在层流罩中进行。 使用无菌塑料巴斯德移液管将切碎的 SVZ 转移到 15 mL 离心管中。确保板中没有残留物。 让组织沉淀物在管底部，并去除剩余的 DPBS。 每个大脑 （2 SVZ） 加入 500 μL 过滤的含木瓜蛋白酶的酶混合物，并将试管在 37 °C 的水浴中孵育 30 分钟。 孵育后，向每个样品中加入 5 mL 在 37 °C 下预热的对照培养基。 将样品以 300 x g 离心 5 分钟。然后，使用微量移液管或真空泵小心去除上清液。 加入 1 mL 对照培养基，小心地机械解聚沉淀，使用火焰抛光的巴斯德玻璃移液器上下移液 10 倍至 20 倍，直到获得均匀的细胞悬液。注意：这是方案中最关键的步骤之一，因为过度或不充分的解聚都会对培养物的产量产生负面影响。 加入 4 mL 对照培养基，倒置混合以洗涤细胞。以 300 x g 离心 5 分钟。然后，去除上清液。 加入 1 mL 完全培养基，上下吹打 10 次以使细胞悬液匀浆，重悬沉淀。 用台盼蓝稀释 1/2 等分试样的细胞悬液后，在显微镜下使用 Neubauer 室对细胞悬液进行计数，或使用自动细胞计数器。确保在单细胞水平上分解培养物。 制备细胞悬液后，将获得的细胞均匀接种在 48 孔板的 8 个孔中，最终体积为 500 μL 完全培养基。注：我们通常从两个 SVZ 获得 20,000 个细胞，最终接种密度约为 2,500 个细胞/mL，以实现培养物的最大产量。 神经球形成将细胞 在 37 °C 和 5% CO2 的加湿培养箱中体外 （DIV） 孵育 5 至 7 天。在这些条件下，分化的细胞死亡，而 NSC 和祖细胞响应于有丝分裂刺激而增殖，形成公认的原代神经球克隆聚集体。注意：EGF 或 bFGF 都可用于诱导神经球形成。然而，这两个生长因子并不完全是可替代的。 使用倒置显微镜耦合相机检查神经球的大小，一旦神经球达到 50 至 100 μm 的大小范围，以 10 倍放大倍率计数孔中形成的所有原代神经球。形成的原代神经球总数用作 SVZ 生态位中存在的 NSC 数量的估计值。 10 天后，从每个孔中收集培养基以开始传代。在 5 到 7 DIV 后进行后续传代，尽管值得注意的是，初级球体可能需要稍长的持续时间才能达到传代培养的理想大小（约 100 μm）。 表 1：培养基解决方案。 描述了对照培养基的配方。制备预混合的激素混合物溶液。可以按照说明提前制备激素储备溶液并储存在 -20 °C。 细胞培养前，用 EGF 和 bFGF 补充对照培养基以制备完全培养基。提供了每种组分的储存规格、储备液和工作浓度。 请点击此处下载此表格。 2. 神经球培养物的扩展 神经球的通过从多孔板中收集含有神经球的培养基，并将其转移到 15 mL 离心管中。通过用几毫升 DPBS 冲洗孔，确保回收尽可能多的细胞。 以 300 x g 离心神经球 5 分钟。然后，去除上清液。 向沉淀中加入 200 μL 酶溶液（参见 材料表），然后轻轻敲击试管底部以使其脱落。在室温下孵育 10 分钟以促进神经球解离。 加入 1 mL 对照培养基以终止酶促反应，并使用 P1000 微量移液器上下移液 10 倍至 20 倍来机械解离神经球。 加入额外体积的 4 mL 对照培养基，倒置混合以洗涤细胞。 将细胞以 300 x g 离心 5 分钟。然后，去除上清液。 加入 1 mL 完全培养基并重悬沉淀，通过上下吹打 10 次使细胞悬液匀浆。注意：如果神经球的原始数量和大小太高，请添加更多完全培养基以稀释细胞悬液，确保可靠的细胞计数。 用台盼蓝稀释 1/2 等分试样的细胞悬液后，使用 Neubauer 腔室对细胞悬液进行计数，或使用自动细胞计数器。 为了扩增细胞培养物，使用完全培养基在适当的培养板或培养瓶中以 10,000 个细胞/cm2 的密度接种细胞（见 表 2）。 在加湿培养箱中，在 37 °C 和 5% CO2 下孵育细胞 5 至 7 DIV，每次传代。注：神经球培养物可以通过重复传代培养（不超过 10 次传代）持续扩增和繁殖，而不会改变其增殖能力。EGF 或 bFGF 都可用于培养;然而，只有在 EGF 存在的情况下才能实现培养物的长期扩增。 自我更新试验传代神经球培养物后，在 96 孔板中接种 1,000 个单个细胞，用完全培养基完成高达 200 μL 的最终体积，得到培养物的最终细胞密度为 5 个细胞/μL。注：接种的细胞数必须尽可能准确。如有必要，准备中间稀释液，以确保在铺板前获得可靠的细胞悬液体积。此外，建议每种条件进行 4 至 5 次重复接种，以减少技术差异。 将细胞在 37 °C 和 5% CO2 下在加湿培养箱中孵育 5 天或直到神经球达到足够的大小（60 至 100 μm）。避免移动或摇晃多孔板以防止神经球聚集。 神经球形成后，使用配备有附加摄像头的倒置相差显微镜计算每个孔中形成的神经球的数量。可分别使用 EGF 或 bFGF 进行自我更新测定。 NSC 培养物的冻存注意：神经球培养物可以冷冻保存以备将来使用，从而最大限度地减少所需的小鼠数量。我们建议将细胞保存至第 10 代。为了冻存细胞，将 1 mL 完全培养基中的细胞悬液转移至正确标记的冻存管中。 向细胞悬液中加入终浓度为 10% 的二甲基亚砜 （DMSO），然后倒置试管轻轻混合。注：DMSO 用作冷冻保护剂，但可能对细胞有毒，因此应迅速执行此步骤。 使用冷冻容器将试管放入 -80 °C 冰箱中，使温度以 1 °C/min 的速度逐渐降低。这种逐渐冷冻的过程可防止在冷冻保存过程中因形成冰晶而引起的细胞损伤。如需长期储存，请将试管保持在 -196 °C 的液氮罐中。 NSC 培养物的解冻注：需要时，可以解冻细胞，并重新扩增培养物以进行实验。从液氮储罐中取出含有冷冻 NSC 的冻存管，并立即将它们置于 37 °C 水浴中直至完全解冻，大约需要 5 分钟。注意：尽量减少浴疗时间至关重要，因为 DMSO 有毒且会影响细胞活力。 将解冻的细胞快速转移到含有 5 mL 预热对照培养基的 15 mL 离心管中。 将细胞以 300 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。加入 1 mL 完全培养基，轻轻上下吹打 10 次以使细胞悬液匀浆，以在接种前重悬沉淀。注意：解冻会影响细胞活力;因此，建议在接种前至少传代细胞一次以进行新的实验。 支原体检测注：支原体污染会损害细胞健康，影响生长速率。因此，支原体检测对于确保实验的完整性和可靠性至关重要。DNA 提取收集至少 100 μL 的细胞培养物用于 DNA 提取。上清液和细胞沉淀均可用于 DNA 提取。将此等分试样储存在 -20 °C 直至提取。 刺穿管盖，使用加热块将等分试样在 99 °C 下煮沸 15 分钟。注意：刺穿管盖可避免在高温下沸腾时管子打开。 以 16,900 x g 离心 5 分钟。将含有 DNA 的上清液转移到新试管中。将装有 DNA 的试管储存在 -20 °C 直至 PCR 检测。 用于支原体检测的 PCR使用以下组分制备 PCR 混合物：8.9 μL 无核酸酶水、3 μL 5x 反应缓冲液、1.2 μL 25 mM MgCl2、0.25 μL 2.5 mM dNTP、0.15 μL Taq 聚合酶和 0.25 μL 浓度为 10 μM 的每种支原体特异性引物（正向，Fw：5’GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3′ 和反向，Rv： 5’GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3’）。 加入 1 μL 基因组提取的 DNA。在层流罩中制备 PCR 混合物，以防止 DNA 污染。 在热循环仪中孵育反应如下：在 95 °C 下初始变性 5 分钟，然后在 95 °C 下变性 30 秒，在 53 °C 下退火 1 分钟，在 72 °C 下延伸 30 秒，最后在 72 °C 下延伸 5 分钟。 为了鉴定所得条带的大小（约 500 bp），将 15 μL DNA PCR 产物与 3 μL 6x 上样染料溶液混合，加载到 2% 琼脂糖凝胶上，并在 100 V 下运行电泳 40 至 50 分钟。 表 2：用于培养的板和培养瓶。 提供了最常用的接种板和培养瓶的尺寸和体积。该表包括每个容器使用的直径、生长面积和培养基体积，以及在扩增条件下（10,000 个细胞/cm2）接种的 NSC 数量示例。 请点击此处下载此表格。 3. 神经球培养物的核转染 试剂的制备DNA 制备在 1.5 mL 试管中制备 25 μL 感受态 大肠杆菌 DH5α 细胞进行转化。 向细胞中加入 1 μL 目标质粒（100 至 200 ng/μL），并在 42 °C 下对其进行热休克 45 秒。在这里，使用含有用于沉默 Snrpn 表达的短发夹 （sh） RNA 的质粒和对照质粒 shSCRAMBLE。注：在整个过程中将感受态细胞置于冰上，以保持转化效果。 用适当的抗生素将转化的细胞接种在 LB 琼脂平板上，并在 37 °C 下孵育 18 小时。将培养皿倒置以防止由于冷凝而形成液滴，这可能会干扰细菌菌落。注：向 LB 培养基中添加适当的抗生素，以专门允许转化细菌的生长。 使用无菌移液器吸头，挑选单个细菌菌落并将其转移到先前装满 250 mL LB 的锥形瓶中，以开始液体培养。避免挑选位于较大靶标菌落周围的小卫星菌落，因为它们可能没有掺入所需的质粒。 将培养瓶在 37 °C 的轨道振荡器上剧烈摇动孵育过夜。 使用无内毒素的大提试剂盒，并按照制造商的说明从细菌培养物中提取纯质粒 DNA。在适当体积的无内毒素水中重构 DNA，以获得 1 至 2 μg/μL 的质粒浓度。注：大量制备的产量取决于培养物的生长。通常，将质粒 DNA 沉淀重悬于 200 μL 的体积中将得到所需的 DNA 浓度。 将带有质粒 DNA 的试管储存在 -20 °C 直至使用。制备一根 1.5 mL 试管，最终体积为 5 μL，其中含有 2 至 6 μg 用于核转染的质粒 DNA。 材料准备制备 nucleofection 溶液。如果使用推荐的试剂盒（参见 材料表），请在 1.5 mL 试管中为每个所需的核转染制备 95 μL 的核转染溶液。移液器和比色皿通常包含在试剂盒中。为每种成核条件准备一个。 根据每种条件准备一个装满 4 mL 预热完全培养基的 T25 培养瓶，并将其保存在培养箱中直至使用。 NSC 的核转染每个条件使用 1 到 2 x 106 个单独的细胞进行评估。将细胞以 300 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。 加入 1 mL DPBS 并通过上下吹打 10 次重悬沉淀，以确保细胞悬浮均匀。 重复离心（步骤 2.1.6）进行第二次洗涤，最后将沉淀重悬于 95 μL 核转染溶液中。注：洗涤步骤对于从对照培养基中去除抗生素并确保有效的核转染至关重要。 将 95 μL 细胞与含有 5 μL 选择用于核转染的每种质粒（总共 2 μg）的预混溶液混合。 使用 P200 微量移液器，将此溶液转移到比色皿中，并将其放入 nucleofector 装置中。 使用 nucleofector 系统的优化 NSC 程序，用所需的质粒对细胞进行成核。 完成电穿孔后，使用试剂盒中提供的巴斯德移液器小心地将温热的完全培养基引入比色皿中。随后，将比色皿的内容物转移到先前制备的含有预热完全培养基的 T25 培养瓶中。电穿孔后，可能会出现细胞死亡、DNA 沉淀和粘性聚集体的形成。避免将其转移到 T25 培养瓶中，因为它可能会降低细胞存活率。注：此步骤至关重要，应尽快执行，以确保高产量的核转染和随后的培养存活。 将有核转染细胞在 37 °C 和 5% CO2 下在加湿培养箱中孵育 3 至 5 天。 核感染细胞的选择策略 A：通过荧光激活细胞分选 （FACS） 进行流式细胞术选择核转染 3 至 5 天后，按照步骤 2.1 传代核转染培养物，并收集获得的所有个体化细胞。 通过 40 μm 细胞过滤器过滤样品以去除细胞聚集体，并使用细胞分选仪流式细胞仪对其进行分析。注意：在每种条件下对相同数量的细胞进行排序以获得比较结果至关重要。 使用细胞仪的软件，根据两种措施对活细胞进行门控：对应于细胞大小的前向散射光 （FSC-A） 和对应于细胞内复杂性的侧向散射光 （SSC-A）。选择具有高 FSC-A 和高 SSC-A 特征的活细胞群。注：或者，在分选前向细胞悬液中添加 0.1 μg/mL 的 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）。这将允许从门控中丢弃死细胞和凋亡小体。 通过绘制 FSC-A 与 FSC-H 参数来丢弃细胞双联体和三联体。选择图对角线中包含的事件，表示单峰。注：当细胞通过激光时，细胞仪会检测电压随时间的变化。FSC-A 表示信号区域，FSC-H 表示峰高。单重体显示 FSC-A 和 FSC-H 之间的比例关系（位于图的对角线上），而由于信号较长，细胞聚集体相对于 FSC-H 显示更大的 FSC-A。 根据所用质粒编码的报告基因的荧光强度选择核转染细胞。例如，当使用 GFP + 时，可以根据 FITC-A 荧光水平与 SSC-A 图来选择细胞。 为每种条件分离所需数量的靶细胞，并将它们直接收集在装满完全培养基的收集管中。 以 10,000 个细胞/cm2 的密度接种有核转染的 NSC。将分选的细胞培养物在 37 °C 和 5% CO2 下在加湿培养箱中孵育。 策略 B：使用质粒中编码的抗生素抗性进行选择核转染 48 小时后，添加适当浓度的抗生素以选择耐药细胞。注：在开始之前，建议在非核染细胞上测试多种浓度的抗生素。最佳抗生素浓度是消除所有非耐药细胞的最低量。例如，我们确定了 NSC 培养物的最佳浓度为 4 μg/mL 抗生素杀稻瘟菌素。 将细胞在 37 °C 和 5% CO2 下在加湿培养箱中孵育 48 小时。 抗生素处理 48 小时后，根据步骤 2.1 传代培养有核感染的细胞。如果神经球仍然很小，则通过以 300 x g 离心 5 分钟从培养基中去除抗生素。重悬细胞，并在培养瓶中仅使用完全培养基培养它们。将细胞在 37 °C 和 5% CO2 下在加湿培养箱中孵育，直到它们可以按照步骤 2.1 扩增。