概要

Ambystoma mexicanumのプレート固定による大腿骨骨切り術の安定化

Published: April 12, 2024
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概要

成熟したウーパールーパーの内部プレート固定を使用した大腿骨骨切り術手術のプロトコルが提示されます。この手順は、水生両生類の四肢の再生と骨折治癒に関する比較研究を行うために使用できます。

Abstract

ウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)は、手足、脳、心臓、尾などの失われた臓器や損傷した臓器を再生する優れた能力を備えているため、再生医療の有望なモデル生物です。ウーパールーパーに関する研究は、前駆細胞の活性化と損傷後の組織回復を支配する細胞および分子経路に光を当てます。この知識は、骨の非結合などの再生不能な損傷の治癒を促進するために適用できます。現在のプロトコルでは、内部プレート固定システムを使用した大腿骨骨切り術の安定化が説明されています。この手順は、水生動物(ウーパールーパー、 Ambystoma mexicanum)での使用に適応されました。≥20 cm の鼻から尾までの軸生ルーパーを使用し、完全に骨化したマウスサイズの同等の大腿骨を使用し、プレートの位置決めと固定、および術後のケアに特別な注意が払われました。この外科的技術は、標準化され安定した骨固定を可能にし、ウーパールーパーの四肢再生との直接比較や、両生類と哺乳類の骨治癒の類似の研究に役立つ可能性があります。

Introduction

ウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)は、尾、脊髄、脳、心臓、鰓、および四肢を含む臓器再生の重要なモデルです1,2,3,4,5。ウーパールーパー四肢の再生に関する詳細な研究により、細胞の脱分化のメカニズムと、切断部位での幹細胞プールである芽球の形成が明らかになりました。胞子細胞が、パターン化された骨格6,7を含むすべての欠損肢部分を再構築する能力があるため、ウーパールーパーは骨治癒研究のための魅力的なモデル生物であるように思われる。最近、いくつかの研究がウーパールーパーの骨生物学に焦点を当て、骨格の形態、細胞組成、および骨化ダイナミクスについて説明しています。

哺乳類では、長骨の骨治癒過程は軟骨内骨化 を介して 発生し、血腫、肉芽組織、軟骨形成、硬骨と織骨へのカルス骨化、骨リモデリングのいくつかの段階で構成されることがわかっています8。最近の研究では、ウーパールーパーの骨治癒9でも同様の段階が観察できることが示されています。

これまで、ウーパールーパーの骨折は、虹彩切除ハサミで骨を単純に切断する非安定化システムで研究されていました。大きな骨折はzeugopodで作成され、骨切り術は骨の1つで行われ、もう1つはサポートとして機能します10,11。対照的に、ラットやマウスなどの哺乳類では、骨折のサイズを制御し、骨のアライメントを確保するために、髄内ピンや骨整列プレートなどの信頼性の高い固定システムを使用して、骨折が日常的に研究されています。

したがって、この方法は、骨切り術の前にウーパールーパー大腿骨の安定した均一な固定を確保することを目的としています。ウーパールーパー研究をマウスやヒトを含む哺乳動物とより同等にするために、髄内ピン12、外部プレート固定器13,14および内部骨整列プレート15,16,17固定が検討された。後者は、適切な骨の固定を確保し、特定の直径のジグリーソーで1つまたは2つのカットを使用することにより、特定のサイズのギャップを作成できることが示されました。ウーパールーパーはAmbystoma mexicanumの水生幼虫を表しているため、創傷が開いており、水と接触しているため、外部固定具が術後の合併症を引き起こした可能性があります。ウーパールーパーは、その発達の非常に遅い時期(20歳18歳)まで二次骨化中心を発達させず、したがってマウスに使用される標準的な髄内釘が骨端に穴を開けるのを防ぐことができない可能性があるため、大きなウーパールーパーに内部プレート固定法を適用することが決定されました。大型のウーパールーパーでは、大腿骨のサイズと骨化の程度が成体マウスに似ているため、チタンプレート固定による中骨端骨切り術が可能になります1

骨折のギャップ サイズは、治癒のダイナミクスと結果を大きく左右します。例えば、マウスでは、0.25mmの安定化骨折は、その小さなサイズと剛性のある安定化により、主に膜内骨化によって治癒します。0.7 mmの骨折は、軟骨内骨化によって治癒し、骨折の周囲に軟骨カルスが形成されます。3.5 mm の臨界サイズの欠陥などの大きな欠陥は完全には治癒しないため、骨折の非癒合16 をモデル化するために使用されます。この研究では、骨切り術前のウーパールーパー大腿骨のプレート固定プロトコルを確立しました 0.7 mm 骨折ギャップの例を使用して、ウーパールーパーの骨の治癒をマウスの治癒と比較することを最終目標としています9.

骨切り術後、骨折は、マウスよりも遅いものの、おそらくウーパールーパーの水生生活様式と細胞分裂速度の遅さのために、軟骨内骨化の過程を経ました。ここで紹介する方法では、硬質プレート固定による0.7mmギャップ骨切り術が示されています。ただし、他のギャップサイズや半柔軟な固定具、および異なる材料のプレートが可能になる可能性があります。全体として、ここで紹介する方法は標準化された骨固定に使用でき、ウーパールーパーの四肢再生と骨の治癒を比較する研究や、標準化された骨折固定を確保するためにさまざまな条件下でのウーパールーパーの骨治癒の研究に役立ちます。

Protocol

次の手順は、ウィーンの治安判事(GZ:MA 58-65248-2021-26)の承認を得て行われました。5〜8歳≥、鼻から尾の先端まで20cmの長いウーパールーパー(Ambystoma mexicanum)を骨折手術と切断に使用しました。手術には男性と女性の両方が使用されました。ウーパールーパーは分子病理学研究所の施設で飼育されました。疼痛と感染症のリスクは、適切な鎮痛薬と抗生物質で管理…

Representative Results

ここで説明する外科手術(図1)は20分から30分続き、外科医と助手が必要です。オプションで、双眼解剖顕微鏡または虫眼鏡システムを使用します。 図1:外科的処置と実験セットアップの概略図(<s…

Discussion

現在記載されている大腿骨プレート固定術と骨切り術の方法は、 Ambystoma mexicanum (ウーパールーパー)などの水生動物への適用を可能にします。この外科的方法は、最近、ウーパールーパーの骨折治癒と四肢再生をマウス9の骨折治癒と比較するために使用されました。マウスと同様に、4穴の固定プレートを自己破壊ネジで骨に取り付けること?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、優れた技術サポートを提供してくれたSabine Stumppと、手術の支援を提供してくれたLidiaGrösserに感謝します。この研究は、Austrian Science Fund [Hertha Firnberg Fellowship number T-1219]、ERC [Advanced Grant, 742046 RegGeneMems]、DFG [CRC 1444]の助成を受けて行われました。

Materials

0.66 mm Gigly wire saw  RISystem RIS.590.120
7.0 Optilene suture  Braun C3090538
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 dilute to 0.03%  prior to using
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL) Richter Pharma AG dilute to 0.5 mg/L  prior to using
Drill bit 0.30 mm RISystem RIS.590.200
Dumont #5 Forceps – Standard/Inox Fine Science Tools 11251-20
Hand drill RISystem RIS.390.130 better to have at least 3 pieces
Micro CT data analyzer Bruker, Billerica, MA, USA SkyScan NRecon software
Micro CT specimen scanner Bruker, Billerica, MA, USA SkyScan 1172 
Moria MC31b Iris forceps – smooth, curved, 10 cm Fine Science Tools 11373-12FST 2 pieces
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid RISystem RIS.301.102
MouseFix plate 4 hole, rigid RISystem RIS.401.110
MouseFix screw, L =2.00 mm RISystem RIS.401.100 need 4 per bone
Narrow Pattern Forceps VWR FSCI11002-12
penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Ring forceps Fine Science Tools 11103-09
scalpel #15 B Braun, Thermo Fischer Scientific 5518032
Square box wrench 0.50 mm RISystem RIS.590.111
Sterile bone wax, 2.5 g Ethicon, Johnson & Johnson W810
Student Fine Scissors – Straight/11.5cm Fine Science Tools 91460-11

参考文献

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記事を引用
Polikarpova, A., Bucher, C., Ellinghaus, A., Okulski, H., Duda, G., Schmidt-Bleek, K., Tanaka, E. M. Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum. J. Vis. Exp. (206), e66648, doi:10.3791/66648 (2024).

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