概要

共培養による線維形成性三次元膵臓がんスフェロイドの増殖

Published: September 27, 2024
doi:

概要

膵臓がんは、依然として治療が最も困難ながんの1つです。したがって、治療効果を評価する前臨床モデルが再現性があり、臨床的に関連性があることが重要です。このプロトコールは、再現性があり、臨床的に関連性のある線維形成性スフェロイドを生成するための簡単な共培養手順を説明しています。

Abstract

膵管腺がん(PDAC)は、5年生存率が<12%の最も致命的ながんの1つです。治療の最大の障壁は、腫瘍を取り囲み、血管新生を減少させる高密度の線維形成性細胞外マトリックス(ECM)であり、一般にデスモプラスラと呼ばれます。がんの治療には、さまざまな薬剤の組み合わせや製剤が試験されており、その多くは前臨床で成功を収めていますが、臨床的には失敗しています。したがって、治療に対する腫瘍の反応を予測できる臨床的に関連性のあるモデルを利用できるようにすることが重要になります。このモデルは、切除された臨床腫瘍に対して以前に検証されています。ここでは、頑健なECMを自然に生成でき、その成長をサポートするための外部マトリックスソースや足場を必要としない、線維形成性三次元(3D)共培養スフェロイドを成長させるための簡単なプロトコルについて説明します。

簡単に説明すると、ヒト膵臓星状細胞(HPaSteC)とPANC-1細胞を使用して、それぞれ1:2の比率で細胞を含む懸濁液を調製します。細胞は、ポリHEMAコーティングされた96ウェル低接着Uウェルプレートに播種されています。プレートを遠心分離して、細胞が最初のペレットを形成するようにします。プレートは5%CO2で37°Cのインキュベーターに保存され、培地は3日ごとに交換されます。プレートを指定された間隔でイメージングして、スフェロイドの体積を測定できます。14日間の培養後、成熟した線維形成性スフェロイドが形成され(すなわち、平均体積0.048 + 0.012 mm3(451 μm x 462.84 μm))、実験的治療評価に利用できます。成熟したECM成分には、コラーゲンI、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニンが含まれます。

Introduction

膵臓がんの予後不良にはさまざまな理由が関連していますが、その中には、検出が遅れる原因となる簡単に検出できるバイオマーカーがないことが挙げられます。もう一つの大きな理由は、組織を取り巻く間質が厚いため、血液供給が減少することです。大量の細胞外マトリックス(ECM)、細胞間相互作用、内皮細胞、さまざまな免疫細胞、周皮細胞、増殖性筋線維芽細胞、線維芽細胞集団、および非腫瘍細胞の存在(一緒にして線維形成反応を構成する)1が、PDACの化学療法および放射線治療耐性2の原因となる厚い間質を構成します.がん細胞と間質細胞は、複雑でダイナミックな双方向の相互作用を持っています。一部の要素は疾患の進行を弱めたり加速させたりしますが、ほとんどのプロセスは腫瘍の発生中に適応します1。これにより、成長因子、血管新生促進因子、プロテアーゼ、接着分子が豊富な環境が提供されます。これらの因子は、血管新生、細胞増殖、転移、および浸潤を促進します3,4。これらが一緒になって、腫瘍に対する免疫と薬物特権の聖域となり、薬剤耐性をもたらします。

デスモプラスラは、免疫細胞および膵臓星細胞(PSC)とともに、さまざまなECMタンパク質からなる複雑な混合物です。これらが一緒になって、細胞が成長するための足場を形成する傾向があります。PSCは、間質コンパートメント5の最大のコンポーネントの1つです。マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、マトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)、がん関連線維芽細胞(CAF)6などの酵素を産生する能力は、それらが線維形成反応の進行に重要な役割を果たす可能性が高いことを示唆しています。ECM、がん関連線維芽細胞(CAF)、および血管系は、PDACの主要な側面です。CAFの中で、筋線維芽細胞と炎症性CAFは、腫瘍誘発性の特性に関与する活性クロストークに関与していると推測されています7。腫瘍上の線維芽細胞形成が広範囲に及ぶほど、予後は不良になります8,9,10

確立された細胞株による単層細胞培養は、薬物毒性を解析するための有用なツールであり続けており、概念実証や創薬研究の出発点として適しています。しかし、確立された細胞培養株には、生殖細胞DNAと臨床的関連性が欠けています11。それらは平らな表面で成長するため、腫瘍の一部である場合とは異なる in vitro 選択基準を受け、異常に分裂し、分化した表現型を失います12。全体として、シングルセル培養は腫瘍の不均一性を制限するため、臨床的関連性を失います。腫瘍の微小環境(ECMなど)の複雑さを正確に表現することはできません。3D培養は、複雑な腫瘍微小環境をより忠実に再現することができます。

3D培養は、1970年代に健康な細胞とその腫瘍性細胞に導入されました13。スフェロイド14を通じて悪性組織の形態と構造を研究するために、いくつかの技術が使用されてきた。間質細胞との共培養は、TMEシグナルをモデル化できます。EMTマーカーのアップレギュレーションは、細胞を星状細胞と共培養したときに見られた15。PDACスフェロイドと間質との相互作用は、ECMコンポーネントとの共培養によってモデル化できます。PSCと特異的に共培養すると、臨床的に関連性のある薬物細胞毒性データが得られることが報告されています16,17,18。PSCはまた、アポトーシスを回避し、さまざまなパラクリン因子19を介してがん細胞の増殖を刺激し、EMT移行を誘導することにより、薬剤耐性を助けます。したがって、薬物または薬物送達システムの成功を評価するために使用される基準に、早い段階からPSCを含めることが重要になります。膵臓癌細胞単独と比較して、PSCが増殖を促進し、組み合わせてより速い増殖をサポートする能力は、免疫不全マウスで2つの細胞株の皮下側面注射を評価したときにもin vivoで見られました20

細胞タイプがECMコンポーネントと相互作用する能力も、共培養スフェロイドを成長させる際に考慮すべきことが重要です。BxPC-3とPANC-1は、コラーゲンへの結合において同等の親和性を有することが報告されています。2つの細胞株はラミニンにも同等に結合しますが、BxPC-3の方がよりよく結合するという報告があります21,22,23,24,25。遊走に関しては、Stahle et al.26は、BxPC-3と比較してPANC-1細胞の運動性が5倍速いことを示しました。PANC-1細胞は主に単一細胞として遊走することも報告されていますが、BxPC-3細胞は密集したシートとして遊走します。細胞の選択は、腫瘍25のサイズにも影響する。BxPC-3腫瘍は、PANC-1から得られた腫瘍よりも27.28大きいことが示されましたが、1つの研究では反対の29のケースが示されました。サイズと運動性の違いにもかかわらず、どちらの細胞もマウスで腫瘍を形成するために長期間の潜伏が必要であることが報告されています。この期間は、BxPC-3 では特に長く、4 週間から 4 か月の範囲です25。しかし、BxPC-328またはBxPC-3がん幹細胞30がより早く目に見える腫瘍を形成したという文献もあり、腫瘍の成長期間にばらつきが見られる可能性があることを示唆しています。したがって、ここに記載されている期間は、腫瘍増殖率の最初のガイドラインとしてのみ役立つはずです。

BxPC-3細胞は、表面に緩い細胞と密集したコアを持つスフェロイドを形成しますが、PANC-1細胞は、多孔質で堅牢なスフェロイド31 とコンパクトなスフェロイドの両方を形成することが報告されています。PANC-1細胞はまた、分化が少なく、より攻撃的であることが報告されています32。攻撃的な性質32 を最前線に保ち、PANC-1細胞の高い運動性、コンパクトなスフェロイドを形成する能力、およびECM成分と相互作用する能力と組み合わせて、PANC-1細胞がスフェロイド研究に選ばれました。

ここ数年、スフェロイド培養は、二次元(2D)培養と比較して、その臨床的関連性において優位性を実証することに成功しています。その関連性は、動物研究の代替としてこの技術を使用し、腫瘍の生物学をよりよく理解するために活用されています。スフェロイドの臨床的関連性は、特にPSCと共培養された場合、剛性33、TGF-βの発現34,35,36,37,38、E-カドヘリン、F-アクチン18,34,36,37、α-SMA 34,35,37などのスフェロイドのさまざまな機能を研究するためにそれらを使用することを可能にしました。38、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDHA)32、HIF-1α35,39、薬剤耐性16,37,40、細胞遊走41、細胞浸潤37、線維化35、放射線耐性42、表現型変化18、不均一性36、相互作用の細胞レベル39およびECM成分の実証37,3839。記載されているデータを取得するために使用されたプロトコルの多くは、Matrigel、吊り下げ法、プリントされた型、またはその他の足場に依存して、スフェロイドとECMの増殖をサポートします。また、この研究では通常、非ヒト線維芽細胞または患者から新たに単離された星状細胞を使用します。腫瘍を生体内疾患に類似させるためには、星状細胞を使用することが重要であるが、新たな抽出物に関連する患者間のばらつきが、これらの研究の再現を困難にしている。

このプロトコルは、開発が容易で、再現性があり、臨床的に関連性があり、足場のないモデルを実証することを目的としており、ECMを自然に生成する共培養の能力のみに依存しています。そのために、PANC-1細胞(単一細胞として移動する自然な傾向があるため)とヒト膵臓星細胞(HPaSteC)を混合したシンプルな共培養法が選択されました。これは、幹細胞のように振る舞い、薬剤耐性が高いためです。Durymanov et al.38による研究をベースラインとして使用して、以下に詳述するプロトコルは、細胞比や培地交換間の期間などのパラメータをさらに最適化した後に確立されました。このプロトコールから得られたスフェロイドは、新薬候補評価のモデルシステムとして使用することができます40

さらに、回転楕円体の文化に詳しくないユーザーにとっては、MISpheroIDナレッジベースの開発について論じたPeirsman et al.43の著作が参考になるかもしれない。これは、ラボプロトコル間の不均一性に対処するのに役立つ可能性のあるいくつかの最小限の情報ガイドラインを確立します。いくつかの制限はありますが、この研究は、培地、細胞株、スフェロイド形成方法、および最終的なスフェロイドサイズの選択が、スフェロイドの表現型特性を決定する上で重要であることを示しました。

Protocol

1. 2D細胞培養 無菌条件下で10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコのModified Eagle Medium(DMEM)でPANC-1細胞を増殖させます。パッセージの前に70%〜80%のコンフルエントまで成長し、20番目の パッセージを超えて使用しないでください。ステップ 4.2.1 で説明されているプロセスを参照してください。注:参考として、20mLの培地中の1 x 106</su…

Representative Results

スフェロイドの増殖に関与する最も重要な3つのステップは、初期細胞数、スフェロイドの播種中の混合ステップ、およびスフェロイドを成長させるためのタイムリーな培地交換の実施です(図1)。さらに、3日目以降のFigure 2 onのメディア変更に精通することは、ウェルあたりのメディア量の増加による効果的?…

Discussion

スフェロイドを増殖させるために選択された期間および細胞比は、以前に報告された研究に基づいていた38。これらの研究を最適化しようと、NIH3T3細胞をHPaSteC細胞に置き換えようとしたところ、スフェロイドの体積とアポトーシスパターンは、PANC-1:HPaSteC比が120:60のときに報告された最適化パラメータ(PANC-1:NIH3T3:: 120:12)と非常によく似ていることが?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

記載されている研究は、サウスダコタ州知事経済開発局、サウスダコタ州評議委員会競争的研究助成プログラム(SD-BOR-CRGP)、およびサウスダコタ州立大学の薬学部の支援を受けて行われました。

Materials

Axio Observer inverted microscope Carl Zeiss 0450-354
Cellometer Auto T4 Nexcelom Bioscience LLC Auto-T4
DMEM, powder, high glucose Gibco 12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568 Abcam ab175712
Fetal Bovine Serum  Cytiva SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488  Abcam ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)  Gibco 14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC) ScienCell 3830
Microscope Nikon Nikon Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates Thermo Scientific 12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser Olympus N/A Discontinued product
PANC-1 ATCC CRL-1469
Poly-HEMA Sigma P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies  Abcam ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies  Abcam ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies Abcam ab53842
Stellate cell media complete kit  ScienCell 5301
Trypsin  MP Biomedicals, LLC 153571 Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v 
Trypsin Neutralization Solution (TNS) ScienCell 103

参考文献

  1. Hingorani, S. R. Epithelial and stromal co-evolution and complicity in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 57-77 (2023).
  2. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nat Med. 22 (5), 497-505 (2016).
  3. Binker, M. G., Binker-Cosen, M. J., Binker-Cosen, A. A., Cosen-Binker, L. I. Microenvironmental factors and extracellular matrix degradation in pancreatic cancer. J Pancreas. 15 (4), 280-285 (2014).
  4. Spano, D., Zollo, M. Tumor microenvironment: a main actor in the metastasis process. Clin Exp Metastasis. 29 (4), 381-395 (2012).
  5. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  6. Sunami, Y., Häußler, J., Kleeff, J. Cellular heterogeneity of pancreatic stellate cells, mesenchymal stem cells, and cancer-associated fibroblasts in pancreatic cancer. Cancers. 12 (12), 3770 (2020).
  7. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. J Exp Med. 214 (3), 579-596 (2017).
  8. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 7 (11), S44-S47 (2009).
  9. Watanabe, I., et al. Advanced pancreatic ductal cancer: fibrotic focus and β-catenin expression correlate with outcome. Pancreas. 26 (4), 326-333 (2003).
  10. Hu, G., et al. Tumor-infiltrating podoplanin+ fibroblasts predict worse outcome in solid tumors. Cell Physiol Biochem. 51 (3), 1041-1050 (2018).
  11. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  12. Monberg, M. E., et al. Occult polyclonality of preclinical pancreatic cancer models drives in vitro evolution. Nat Commun. 13 (1), 3652 (2022).
  13. Emerman, J. T., Pitelka, D. R. Maintenance and induction of morphological differentiation in dissociated mammary epithelium on floating collagen membranes. In Vitro. 13 (5), 316-328 (1977).
  14. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  15. Kikuta, K., et al. Pancreatic stellate cells promote epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 403 (3-4), 380-384 (2010).
  16. Lee, J. -. H., et al. Microfluidic co-culture of pancreatic tumor spheroids with stellate cells as a novel 3D model for investigation of stroma-mediated cell motility and drug resistance. J Exp Clin Cancer Res. 37 (1), 4 (2018).
  17. Wong, C. -. W., Han, H. -. W., Tien, Y. -. W., Hsu, S. -. H. Biomaterial substrate-derived compact cellular spheroids mimicking the behavior of pancreatic cancer and microenvironment. Biomaterials. 213, 119202 (2019).
  18. Liu, X., et al. 3D heterospecies spheroids of pancreatic stroma and cancer cells demonstrate key phenotypes of pancreatic ductal adenocarcinoma. Transl Oncol. 14 (7), 101107 (2021).
  19. Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Res. 68 (7), 2085-2093 (2008).
  20. Bachem, M. G., et al. Pancreatic carcinoma cells induce fibrosis by stimulating proliferation and matrix synthesis of stellate cells. Gastroenterology. 128 (4), 907-921 (2005).
  21. Greco, E., et al. Pancreatic cancer cells invasiveness is mainly affected by interleukin-1β not by transforming growth factor-β1. Int J Biol Markers. 20 (4), 235-241 (2005).
  22. Arao, S., Masumoto, A., Otsuki, M. β1 integrins play an essential role in adhesion and invasion of pancreatic carcinoma cells. Pancreas. 20 (2), 129-137 (2000).
  23. Sawai, H., Yamamoto, M., Okada, Y., Sato, M., Akamo, Y., Takeyama, H., Manabe, T. Alteration of integrins by Interleukin-1alpha in human pancreatic cancer cells. Pancreas. 23 (4), 399-405 (2001).
  24. Chen, J., et al. Expression and function of the epidermal growth factor receptor in physiology and disease. Physiol Rev. 96 (3), 1025-1069 (2016).
  25. Deer, E. L., et al. Phenotype and genotype of pancreatic cancer cell lines. Pancreas. 39 (4), 425 (2010).
  26. Stahle, M., et al. Mechanisms in LPA-induced tumor cell migration: critical role of phosphorylated ERK. J Cell Sci. 116, 3835-3846 (2003).
  27. Aubert, M., et al. Decrease of human pancreatic cancer cell tumorigenicity by α1, 3galactosyltransferase gene transfer. Int J Cancer. 107 (6), 910-918 (2003).
  28. Miknyoczki, S. J., Chang, H., Klein-Szanto, A., Dionne, C. A., Ruggeri, B. A. The Trk tyrosine kinase inhibitor CEP-701 (KT-5555) exhibits significant antitumor efficacy in preclinical xenograft modelsof human pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 5 (8), 2205-2212 (1999).
  29. Fukasawa, M., Korc, M. Vascular endothelial growth factor-trap suppresses tumorigenicity of multiple pancreatic cancer cell lines. Clin Cancer Res. 10 (10), 3327-3332 (2004).
  30. Hernández-Camarero, P., et al. Pancreatic (pro) enzymes treatment suppresses BXPC-3 pancreatic Cancer Stem Cell subpopulation and impairs tumour engrafting. Sci Rep. 9 (1), 11359 (2019).
  31. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Eng Part C Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  32. Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
  33. Kpeglo, D., et al. Modeling the mechanical stiffness of pancreatic ductal adenocarcinoma. Matrix Biol Plus. 14, 100109 (2022).
  34. Jang, S. -. D., et al. Anti-cancer activity profiling of chemotherapeutic agents in 3D co-cultures of pancreatic tumor spheroids with cancer-associated fibroblasts and macrophages. Cancers. 13 (23), 5955 (2021).
  35. Pednekar, K. P., Heinrich, M. A., van Baarlen, J., Prakash, J. Novel 3D µtissues mimicking the fibrotic stroma in pancreatic cancer to study cellular interactions and stroma-modulating therapeutics. Cancers. 13 (19), 5006 (2021).
  36. Kim, S. -. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305 (2020).
  37. Hwang, H. J., Oh, M. -. S., Lee, D. W., Kuh, H. -. J. Multiplex quantitative analysis of stroma-mediated cancer cell invasion, matrix remodeling, and drug response in a 3D co-culture model of pancreatic tumor spheroids and stellate cells. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 258 (2019).
  38. Durymanov, M., et al. Subcutaneous inoculation of 3D pancreatic cancer spheroids results in development of reproducible stroma-rich tumors. Transl Oncol. 12 (1), 180-189 (2019).
  39. Giustarini, G., Teng, G., Pavesi, A., Adriani, G. Characterization of 3D heterocellular spheroids of pancreatic ductal adenocarcinoma for the study of cell interactions in the tumor immune microenvironment. Front Oncol. 13, 1156769 (2023).
  40. Alseud, K., et al. Synthesis and biological activity of 11-oxygenated and heterocyclic estrone analogs in pancreatic cancer monolayers and 3D spheroids. Bioorg Med Chem. , (2024).
  41. Fitzgerald, A. A., et al. Fibroblast activation protein regulates natural killer cell migration, extravasation and tumor infiltration. bioRxiv. , 429622 (2021).
  42. Wishart, G., Gupta, P., Schettino, G., Nisbet, A., Velliou, E. 3D tissue models as tools for radiotherapy screening for pancreatic cancer. Br J Radiol. 94 (1120), 20201397 (2021).
  43. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  44. Durymanov, M., Kroll, C., Permyakova, A., Reineke, J. Role of endocytosis in nanoparticle penetration of 3D pancreatic cancer spheroids. Mol Pharm. 16 (3), 1074-1082 (2019).

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Bahl, R., Venegas Mata, C., Neth, B., Meinzinger, L., Deppe, A. C., Jahnke, H., Blackwell, C., Durymanov, M., Reineke, J. Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture. J. Vis. Exp. (211), e66625, doi:10.3791/66625 (2024).

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