示差走査蛍光法によるCD40タンパク質-ウンベリフェロン相互作用の検出

化合物溶液、タンパク質溶液、および色素をPBS溶液に導入しました。その後、デジタル加熱振とうドライバスを用いて試料を段階的に加熱し、複合体系内の蛍光強度の変化を測定することでタンパク質の熱安定性を評価しました。詳細な手順を以下に概説し、 図 1 にプロトコルの概要を示します。 1. 溶液の調製 616.75 μL の DMSO 溶液に 0.1 mg のウンベリフェロンを添加して、1 mM のウンベリフェロン溶液を調製します( 材料の表を参照)。 0.1 mg の CD40 を 500 μL の ddH2O 溶液に加えて、200 μg/mL の CD40 タンパク質溶液を調製します( 「材料の表」を参照)。 500x Orange色素1 μLを9 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加え、500x Orange色素溶液を調製します( 材料の表を参照)。注:上記の操作を氷上で行い、ピペットの最小範囲が0.1μLであるため、最初にオレンジタンパク質色素を10倍に希釈して、その後の使用を容易にします。 2.染料性能試験 500xオレンジ色素をPBS溶液に加え、希釈して色素(1:500、1:1000、1:2000、1:4000)を実現します。注意: DMSOの最終濃度が2%(v / v)を超えないようにしてください。 蛍光マイクロプレートリーダーの電源を入れ、10分間予熱します。 コンピュータとデータ集録ソフトウェアを順番に開きます( 資料の表を参照)。 [装置]をクリックし、対応する蛍光マイクロプレートモデルを選択し、データ取得ソフトウェアで[OK]を選択します。注:蛍光マイクロプレートの予熱が終了し、パネルに温度が表示されるのを待ってから、データ収集ソフトウェアを開いて、装置とソフトウェア間の接続が成功することを確認してください。 Acquisition Settingsをクリックし、データ取得ソフトウェアでFluorescenceを選択します。 Wavelengthsインターフェイスでプログラムを編集します:Lm1 = 470 nm、570 nm、[OK]を選択します。注:オレンジ色の色素は、300 nmのUV光または470 nmの可視光で励起でき、570 nmで発光を測定できます。 異なる濃度のオレンジ色素(1:500、1:1000、1:2000、1:4000)とPBSを100 μL/ウェルの96ウェルプレートに加えます。注:溶液をPBSに添加する前にDMSOに溶解し、調製プロセス中に2000 x g で完全にボルテックスして、染料が沈殿する傾向による完全な溶解を確保します。 96ウェルプレートを装置の検出ステージにセットし、データ取得ソフトウェアの Read ボタンをクリックして、室温で各色素濃度の蛍光を13回、毎回2分間隔で測定します。 各決定後に[エクスポート]ボタンをクリックし、[XML XLS TXTにエクスポート]を選択し、[すべてのプレート]を選択し、[出力形式のプレート]を選択し、最後に[OK]をクリックして、データを「XLS」形式でフォルダに保存し、さらに分析します。注:これらのステップは、室温でのオレンジ色素の自家蛍光に対する連続測定の影響を判断し、最適な染色濃度を特定するのに役立ちます。 デジタル加熱振とうドライバスをオンにし、加熱温度を35°Cに、加熱時間を2分に設定します。 1.5 mLの微量遠心チューブで最適な希釈比の色素を調製し、デジタル加熱振とうドライバスに2分間入れます。 PBS溶液と35°Cで加熱した染色溶液を、ウェルあたり100 μLの容量で96ウェルプレートに加えます。 96ウェルプレートを装置の検出ステージにセットし、データ集録ソフトウェアの Read ボタンをクリックします。 加熱温度を40°Cに、加熱時間を2分に設定します。 96ウェルプレートの色素溶液をピペットで1.5 mL微量遠心チューブに戻し、装置内で2分間加熱します。 ステップ2.12-2.15とステップ2.9の操作を繰り返して、それぞれ35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、95°Cで染料溶液の吸光度をテストします。注:これらのステップは、35°Cから95°Cの勾配で連続加熱したオレンジ色の染料の自家蛍光の安定性を決定するのに役立ちます。 急激な温度低下や間違った液体の追加を避けるためには、迅速に作業することが重要です。これは実験エラーにつながる可能性があります。 3. タンパク質の温度融解(Tm)の検出 CD40タンパク質とオレンジ色素をPBS溶液と組み合わせ、それぞれ5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、1:500の最終濃度を達成します。 ステップ 2.2 から 2.6 とステップ 2.10 から 2.16 で概説した操作を繰り返して、それぞれ 35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、55 °C、60 °C、70 °C、75 °C、80 °C、85 °C、90 °C、95 °C の温度での CD40 タンパク質溶液の吸光度を評価します。 手順 2.9 を繰り返してデータを保存および分析し、その後、データ分析ソフトウェアを使用して Tm 値を計算します ( 資料の表を参照)。 CD40タンパク質、ウンベリフェロン、およびオレンジ色素をPBS溶液に添加して、それぞれ5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、10 μM、および1:500の最終濃度を得ます。注:溶液調製中の激しいボルテックスは、PBS中の色素、CD40タンパク質、およびウンベリフェロンの均一な分布を確保するために不可欠です。 手順3.2〜3.3の操作を繰り返して、それぞれ35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C、90°C、および95°Cの温度でCD40-ウンベリフェロン複合体溶液の吸光度を測定します。注:これらのステップは、CD40タンパク質およびCD40-ウンベリフェロン複合体のTm値を決定するために実施され、最適なCD40タンパク質のウンベリフェロンへの結合濃度を特定することを目的としていました。