このプロトコルは、ペリクルバイオフィルムを開発するための堅牢な方法を説明しています。この分析法は、さまざまな培養量に拡張可能であり、さまざまな実験目的に容易に採用できます。この分析法の設計により、いくつかのマイコバクテリア種のバイオフィルム形成能を定性的または定量的に評価することができます。
多くの細菌は、複雑な自然群集で繁殖し、コミュニケーション、協力、競争など、多細胞性の主要な属性を示しています。細菌の多細胞性挙動の最も一般的な症状は、バイオフィルムの形成であり、多くの場合、病原性に関連しています。バイオフィルムは、抗菌剤に対する避難所を提供し、抗菌薬耐性の出現を促進します。振とうフラスコの液体培養物で細菌を培養する従来の慣行は、自然界での細菌の適切な生理学的成長を表現できず、その結果、その複雑なダイナミクスの理解が制限されます。特に、バイオフィルムに存在する細菌の代謝プロファイルと転写プロファイルは、自然に成長する細胞のプロファイルと非常によく似ています。この並列性は、基礎研究とトランスレーショナル研究の理想的なモデルとしてのバイオフィルムの重要性を強調しています。この記事では、 Mycobacterium smegmatis をモデル生物として利用し、ペリクルバイオフィルムを培養する技術を説明することに焦点を当てています。このアプローチは、さまざまな培養量に適応可能であり、抗菌研究などの多様な実験目的への実装を容易にします。さらに、このメソッドの設計により、わずかな調整でさまざまなマイコバクテリア種のバイオフィルム形成能力を定性的または定量的に評価できます。
バクテリアは単細胞の実体として生き残ることができます。しかし、ほとんどの生理学的に関連する条件では、彼らはコミュニティの模倣物に組織化されます。バイオフィルムは、自己生成マトリックス1に包まれた凝集細胞によって形成される細菌のコミュニティ組織として広く認識されています。このようなアセンブリは、初期の多細胞性の特徴を持ち、細菌系により高いストレス耐性を提供します。バイオフィルムは抗菌薬に耐性があることが多く、微生物感染の約80%に関与していると推定されています2,3。
シェイクフラスコとプレートベースの培養は、伝統的に細菌培養の通常の方法でした。その大きな受容性と成功は、取り扱いの容易さ、再現性、およびスケーラビリティに起因する可能性があります。しかし、生理学的文脈の欠如は、そのようなシステムを使用して生成された知識の翻訳の可能性を制限します4。したがって、バイオフィルムは細菌の病態生理学を研究するための魅力的なモデルシステムになりつつあります。バイオフィルムは、自然条件を密接に反映した動的モデルシステムを提供し、研究者が栄養勾配や空間的不均一性などの生理学的側面を再現することを可能にします5,6。
バイオフィルムのライフスタイルは、悪名高い 結核菌を含むマイコバクテリアがバイオフィルム形成に長けているため、マイコバクテリアの研究に特に関連しています7。バイオフィルム内で増殖する能力は、感染時の宿主組織での持続性に貢献します。バイオフィルムのライフスタイル8に関連する固有の抗生物質耐性を考えると、マイコバクテリア症の治療において手ごわい課題を提起します。バイオフィルムはまた、複雑な微生物群集内でマイコバクテリアが採用する独自の代謝適応と栄養素利用戦略の調査を可能にするため、マイコバクテリア代謝を研究するための理想的なモデルシステムを提供します9。
バイオフィルムは、マイコバクテリア研究10のより優れたモデルシステムとしてますます受け入れられていますが、特に異なる研究所で実施された研究間の類似性を引き出すためには、一貫性があり再現性のある標準操作手順が必要です。ここで概説する方法は、マイコバクテリア種である M.smegmatisのバイオフィルム形成手順を説明しています。 M. smegmatis は、その非病原性およびより速いバイオフィルム形成速度を考えると、マイコバクテリアバイオフィルムを研究するためのよりアクセスしやすいモデルです。この分析法は、抗マイコバクテリアスクリーニング、代謝物抽出、オミクス研究などのアプリケーションに合わせて変更することができます。
微生物の多細胞生活様式は、ほぼ1世紀前に報告されました。しかし、臨床研究は依然としてまばらであり、その主な原因は堅牢な方法の欠如です14。バイオフィルム生物学の研究で説明されている方法は、多くの場合、適応が困難です。ここでは、重要なステップのデモンストレーションに支えられた詳細な方法論により、プロトコルの再現性が向…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、アミテシュ・アナンドに授与されたDBT-Ramalingaswami Fellowshipによって支援されました。
0.2 µM PVDF syringe filter | Axiva | SFNY04 R | |
1 mL tips | Genetix | GXM-611000 C | |
10 µL tips | Genetix | GXM-6110 C | |
200 µL tips | Genetix | GXM-61200C | |
6-well polypropylene plates | Tarsons | 980010 | |
Amber tubes | Tarsons | 546051 | |
Autoclave | Hospharma | ||
Biosafety Cabinet A II | MSET | ||
Blotting paper | Any suitable vendor | ||
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid | Sigma | 251275 | |
Cuvettes | Bio-Rad | 2239955 | |
Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
Gel documentation system | Bio-Rad | ||
Glass Beads | Sigma | G8772 | |
Glucose | Sigma | 49139 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Inoculation loops | Genaxy | HS81121C | |
L-Aspargine | Sigma | A0884 | |
LB-agar | Himedia | M1151 | |
LB-media | Himedia | M575 | |
M. smegmatis mc2155 cryo-stock | ATCC | 700084 | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
Micropipettes | Gilson | ||
Parafilm | Tarsons | ||
Petri Dish | Tarsons | 460020 | |
pH meter | Labman Scientific Instruments | ||
Plate Reader | Tecan | ||
Polypropylene test tubes | Genaxy | GEN-14100-PS | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
Rifampicin | MedchemExpress | HY-B0272 | |
Serological pipette | SPL Life Sciences | 95210 | |
Shaker Incubator | Eppendorf | ||
Spatula | |||
Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Static Incubator | CARON | ||
Sterile 10 mL syringe | Becton Dickinson | 309642 | |
Sterile 50 mL syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
Tween-80 | Sigma | P1754 | |
Weighing balance | Sartorius | ||
Zinc sulfate | Sigma | Z0251 |