概要

間質流を有する浸潤性神経膠腫微小環境の光重合性ヒアルロン酸コラーゲンモデル

Published: October 18, 2024
doi:

概要

私たちは、間質液の流れを組み込んだ浸潤前部の神経膠腫腫瘍微小環境を再現する方法を提示します。このモデルは、ヒアルロン酸-コラーゲンI型ハイドロゲルを組織培養インサートに含ませたもので、液圧ヘッドを適用することができる。浸潤を定量化し、細胞を単離または溶解することができます。

Abstract

膠芽腫の再発は、治療の成功に対する主要な障害であり、外科的切除にアクセスできない健康な組織への神経膠腫幹細胞(GSC)の浸潤によって引き起こされます。組織レベルの体液移動、または間質性流体の流れ(IFF)は、腫瘍微小環境(TME)に依存する方法でGSCの浸潤を調節し、IFFとTMEの両方を組み込んだモデルシステムの必要性を強調しています。我々は、神経膠芽腫における浸潤性TMEを再現するためのアクセス可能な方法、すなわちヒトGSC、アストロサイト、および組織培養インサートに播種されたミクログリアからなるヒアルロン酸-コラーゲンIハイドロゲルを提示する。上昇したIFFは、ハイドロゲルに流体圧力ヘッドを適用することで表すことができます。さらに、このモデルは、細胞比、流量、またはマトリックスの剛性における患者間または患者内の違いを再現するように調整できます。浸潤は定量化でき、ゲルはGSC浸潤、フローサイトメトリー、タンパク質またはRNA抽出、イメージングなど、さまざまな結果を得ることができます。

Introduction

膠芽腫は、臨床的に利用可能な治療法2,3によって中等度にしか延長されない短い生存期間1を特徴とする壊滅的な疾患です。効果的な治療に対するこの障害は、主に、切除や再発腫瘍の播種にアクセスできない化学療法抵抗性神経膠腫幹細胞(GSC)の高浸潤性の性質によって引き起こされています4。同時に、GSCは高度に可塑性であり、腫瘍微小環境(TME)の多様な刺激に応答して生存し、侵入します5,6。具体的には、人口密度の高い腫瘍と漏出性血管系は、腫瘍の境界で急激な圧力差を生み出し、GSC浸潤と相関する異なる領域で間質液の流れ(IFF)を増加させます7。この増加したIFFは8,9,10に影響を及ぼし、薬理学的阻害に適した分子経路を介して8,9GSCの浸潤をしばしば増強します。しかし、このプロセスは、神経膠腫の浸潤に対するTMEのグリアの影響によって混乱します。実際、グリアは多くの状況で神経膠腫の浸潤を調節すると説明されており11、私たちの研究室の予備的な証拠は、IFF 増強神経膠腫の浸潤に対するグリアの同様の影響を示しています12。そこで、当研究室では、IFFとglia-GSCの相互作用の両方を組み込んで、これらの浸潤性腫瘍境界領域を再現する調整可能な3D TMEモデルを開発しました。これにより、IFF、グリア、および/または候補治療薬の影響を受けるGSC浸潤およびその他の結果(すなわち、表面または細胞内タンパク質発現、RNA発現など)を定量化します12図1)。

TMEモデルは、広く発表されている他の組織培養インサートベースの間質液フローアッセイ(すなわち、静的/フローアッセイ)と類似しています8,9,10,13,14,15,16,17,18。このモデルの主な違いは、非独占的で調整可能なコラーゲン-ヒアルロン酸マトリックスの組み込み、患者のTMEを代表する比率でアストロサイトとミクログリアをマトリックスに含めること12、およびシステム全体がウェルプレートに閉じ込められ、外部チューブ、リザーバー、またはポンプがないことです。ヒアルロン酸は、脳の細胞外マトリックス19の主要な成分の一つであるが、体液の流れを可能にするには十分ではない。したがって、コラーゲンIが混合物に含まれる。架橋は、紫外線(UV)にさらされると、光開始剤からフリーラジカルが生成され、メタクリル化されたヒアルロン酸分子間の化学的架橋を生成するフリーラジカル開始連鎖重合20と、酸に保存されたコラーゲンの中和と熱にさらされてコラーゲン繊維を形成する212223の2つのステップで発生します。

このアッセイに最適化された種々のパラメータは、チオール修飾ヒアルロン酸-コラーゲンハイドロゲル8,12を用いた以前に発表された研究で説明されている。具体的には、このアッセイに使用された細胞(初代ヒトGSCs 24、初代ヒト皮質アストロサイト、および不死化ヒトミクログリア)は、GSC成長因子、0.5% v/v N-2および1% v/v B-27を添加したアストロベース培地からなるゲル中で3日間少なくとも60%生存率を示します12。ゲルを分解しなければならない場合(タンパク質抽出やフローサイトメトリーなど)では、コラゲナーゼとディスパーゼを使用し、十分な生存率を維持します(図2)。

浸潤を定量するには、GSCをマトリックス中のグリアと結合する前に蛍光標識する必要があります。これは、Hoechst 33342(後述)、細胞トラッカー12、遺伝子改変、または形質導入による標識によって達成され得る。いずれにせよ、新しいマーカーで標識された細胞の生存率は、TMEモデルに組み込む前に測定する必要があります。あるいは、浸潤が定量化されず、タンパク質抽出、RNA抽出、またはその他の結果のためにゲルが回収される場合、ゲル調製プロセス中に細胞を蛍光標識する必要がないことがよくあります。その場合、ゲルは、イメージングのためにホルマリン固定するか、RNA抽出のために分解して細胞を溶解するか、フローサイトメトリーのためにプロテアーゼを使用して分解し、その後、ウェスタンブロットまたはその他のタンパク質研究のためにタンパク質溶解バッファーで溶解することができます。

ここでは、静的な流動条件下で、ヒトアストロサイト、ミクログリア、および患者由来のGSCを患者が定義した比率(4:1:112)で1.2 mg/mLコラーゲンI、4 mg/mL HAマトリックスに組み込むためのプロトコールを提示する。アッセイに使用される特定のパラメータ(すなわち、細胞比、硬さ、細胞タイプなど)は、生存率が適切であれば、さまざまな状況を表すように変更することができます。

Figure 1
図1:流体圧力ヘッド下のハイドロゲル中のGSC、アストロサイト、ミクログリアからなるTMEモデルの図。 細胞は、組織培養インサート内のコラーゲン-ヒアルロン酸ハイドロゲルに埋め込まれます。重力がネットの下向きの流れを駆動します。組織培養インサートメンブレンの細孔により、下向きに侵入した細胞が組織培養インサートの底面に付着し、これらの細胞を固定、イメージング、定量化することができます。BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ハイドロゲル分解後の細胞生存率。 G34(GSC)、アストロサイト、およびミクログリアをTMEモデルに4:1:1で播種し、37°Cで21時間インキュベートしました。 0.3 mg/mL コラゲナーゼ + 0.02 mg/mL ディスパーゼを使用して、合計 30 分、45 分、または 60 分でピペッティングして 15 分ごと(30 分条件)または30分後に 15 分間隔(45 分および 60 分条件)にピペッティングして混合し、ゲルを除去および分解しました。ゲルを分解した後、細胞をアクリジンオレンジ(全細胞)およびヨウ化プロピジウム(死細胞)で染色し、自動セルカウンターを用いてカウントしました。生存率は、TMEモデル内のすべての細胞について報告されます。細胞は30〜60分にわたって少なくとも70%の生存率を維持した。データはSEM±平均として表示されます。n = 3 生物学的複製。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

このプロトコルは、Virginia Tech Institutional Biosafety Committeeによって定められたガイドラインに準拠して開発されました。 注:特に指定がない限り、すべての手順はBSL-2細胞培養キャビネットで行ってください。ヒト細胞の使用に関するガイダンスについては、機関のバイオセーフティ委員会にご相談ください。 1. ゲル調製の…

Representative Results

浸潤(図3)、生存率、およびフローサイトメトリーによるKi67とCD71の発現(図4)に関する代表的なデータは、以前にチオ修飾ヒアルロン酸-コラーゲンハイドロゲル12について発表されたGSC株について提供されている。TMEモデル内のアストロサイトとミクログリアの存在は、細胞株に依存するGSC浸潤に異なる影?…

Discussion

TMEモデルの組み立てには、1)細胞を継代し、同様の条件間で細胞を分離する、2)すべての条件に対して濃縮コラーゲン溶液を組み立てる、3)各条件にゲル成分(細胞、コラーゲン、メタクリル化ヒアルロン酸、光開始剤)を組み合わせる、4)ゲルをめっきする、5)UV曝露と熱による架橋、6)流体圧力ヘッドを追加する、の6つの基本的なステップが含まれます。18時間以上経?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究に対する資金源である国立衛生研究所国立がん研究所(R37 CA222563 to J.M.)、コールター財団(J.M.)、バージニア工科大学ICTAS-CEH(J.M. & J.H.)に感謝します。このアッセイで使用されたGSCは、ハーバード大学医学部のJakub Godlewski博士によって導出されました。

Materials

12 Well Tissue Culture Plate, Sterile Celltreat Scientific Products  229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, Sterile DOT Scientific 667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA  Thorlabs  M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask – Vent Cap, Sterile Celltreat Scientific Products 229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm Diameter Millicell PI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology Grade Thermo Fisher Scientific T038181000CS Ethanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull) ScienCell Research Laboratories 1801 Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. 
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco) Thermo Fisher Scientific 12587010
BSA (MACS) Miltenyi Biotec  130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen) Fisher Scientific  25-0719-41
Cell Counting Chambered Slides Nexcelom Bioscience CHT4-PD100-002
Cell Scrapers Biologix USA  70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience) VWR  NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge – Low-Speed Eppendorf  5702 R Centrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, Corning Fisher Scientific 07-200-108 V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific) Thermo Fisher Scientific 50116047
Collagen I, High Concentration, Rat Tail Corning 354249
Collagen I, Rat Tail Corning 354236 "Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1) United States Biological C7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 – 700 nm Thorlabs COP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips  Amazon B01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7)  United States Biological D3760
DMEM, high glucose (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11330032
EVOS FL Invitrogen AMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco) Thermo Fisher Scientific 26140079 For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich)  Millipore Sigma HT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen) Thermo Fisher Scientific 00-5523-00
Glioma stem cells n/a n/a Can be patient derived or commercial glioma stem cell lines. 
Guava easyCyte HT System Millipore Sigma 0500-4008 Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich)  Millipore Sigma H6648
HEPES (1 M) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max  Thorlabs DC2200 Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific) Thermo Fisher Scientific 62249
Human Astrocytes ScienCell Research Laboratories 1800 Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco) Thermo Fisher Scientific PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco) Thermo Fisher Scientific PHG0021
Immortalized Human Microglia – hTERT Applied Biological Materials  T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 position Benchmark Scientific  H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibody Miltenyi Biotec 130-120-420
LED UV Curing Meter Gigahertz-Optik X1-RCH-116 Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)  Advanced Biomatrix 5269-100MG  Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific L24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA) Advanced Biomatrix 5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific) Fisher Scientific 75-997-203 Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco) Thermo Fisher Scientific 17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco) Thermo Fisher Scientific 10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & Mg Quality Biological 119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2) VWR  97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma) Fisher Scientific  SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco) Thermo Fisher Scientific 25200056
ViaStain AOPI Staining Solution Nexcelom Bioscience CS2-0106

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記事を引用
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