概要

無細胞発現系のカプセル化による細菌グルタミン酸受容体チャネルの再構成

Published: March 08, 2024
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概要

このプロトコルは、脂質二重層へのモデル膜タンパク質の合成および取り込みの研究のために、巨大単層小胞(GUV)内に無細胞発現(CFE)システムをカプセル化するために使用される逆エマルジョン法を説明しています。

Abstract

無細胞発現(CFE)システムは、合成生物学における強力なツールであり、合成細胞におけるバイオセンシングやエネルギー再生などの細胞機能のバイオミミクリーを可能にします。しかし、広範囲の細胞プロセスを再構築するには、膜タンパク質を合成細胞の膜にうまく再構成する必要があります。可溶性タンパク質の発現は通常、一般的なCFEシステムで成功しますが、合成細胞の脂質二重層における膜タンパク質の再構成は困難であることが証明されています。本研究では、モデル膜タンパク質である細菌のグルタミン酸受容体(GluR0)を巨大単層小胞(GUV)に再構成する方法を、合成細胞内でCFE反応をカプセル化し、インキュベーションすることに基づいて、モデル合成細胞として紹介します。このプラットフォームを利用して、GluR0のN末端シグナルペプチドをプロテオロドプシンシグナルペプチドに置き換えることで、GluR0のハイブリッドGUVの膜への共翻訳転座の成功に対する効果が実証されます。この方法は、合成細胞中のさまざまな膜タンパク質を無細胞で再構成することを可能にする堅牢な手順を提供します。

Introduction

ボトムアップ合成生物学は、バイオエンジニアリング、ドラッグデリバリー、再生医療など、数多くの応用が期待できる新興分野として、過去10年間で関心が高まっています1,2。特に、ボトムアップ合成生物学の礎石としての合成細胞の開発は、合成細胞の有望な応用と、in vitro生物物理学的研究を容易にするその細胞様の物理的および生化学的特性により、幅広い科学コミュニティを引き付けています3,4,5,6 .合成細胞は、多くの場合、細胞サイズの巨大単層小胞(GUV)で操作され、そこでさまざまな生物学的プロセスが再現されます。細胞細胞骨格の再構成7,8、光依存性エネルギー再生9、細胞コミュニケーション10,11、およびバイオセンシング12は、合成細胞における細胞様挙動を再構築するためになされた努力の例である。

一部の細胞プロセスは可溶性タンパク質に依存していますが、センシングやコミュニケーションなどの天然細胞の多くの特性は、イオンチャネル、受容体、トランスポーターなどの膜タンパク質を利用することがよくあります。合成細胞の発生における大きな課題は、膜タンパク質の再構成です。脂質二重層における膜タンパク質再構成の従来の方法は、界面活性剤を介した精製に依存していますが、このような方法は手間がかかり、発現宿主に毒性のあるタンパク質には効果がなく、GUVの膜タンパク質再構成には適していないことがよくあります13

タンパク質発現の代替方法は、無細胞発現(CFE)システムです。CFEシステムは、細胞溶解物または精製転写翻訳装置14を用いて、さまざまなタンパク質のin vitro発現を可能にする合成生物学における強力なツールである。CFEシステムは、GUVにカプセル化することもでき、したがって、光収集合成細胞9または機械感受性バイオセンサー15,16の作成など、さまざまなアプリケーション向けにプログラム可能な区画化されたタンパク質合成反応を可能にする。組換えタンパク質発現法と同様に、CFEシステムでは膜タンパク質発現が困難です17。CFEシステムにおける凝集、ミスフォールディング、翻訳後修飾の欠如は、CFEシステムを用いた膜タンパク質合成の成功を妨げる主要なボトルネックです。CFEシステムを用いたボトムアップ膜タンパク質再構成の難しさは、シグナルペプチド、シグナル認識粒子、トランスロコン、シャペロン分子に依存する複雑な膜タンパク質生合成経路が存在しないことが一因です。しかし、最近では、翻訳中にミクロソームやリポソームなどの膜構造が存在すると、膜タンパク質の発現が成功することが複数の研究で示唆されています18,19,20,21。さらに、EaglesfieldらおよびSteinküherらは、シグナルペプチドとして知られる特定の疎水性ドメインを膜タンパク質のN末端に含めることで、その発現を有意に改善できることを発見した22,23。全体として、これらの研究は、合成細胞における膜タンパク質の再構成の課題は、タンパク質の翻訳がGUV膜の存在下で行われ、適切なN末端シグナルペプチドが利用されれば克服できることを示唆しています。

ここでは、GUVにおける膜タンパク質再構成のための組換え要素(PURE)CFE反応を用いたタンパク質合成のカプセル化のためのプロトコールを紹介します。モデル膜タンパク質として細菌のグルタミン酸受容体24 (GluR0)を選択し、そのN末端シグナルペプチドが膜再構成に及ぼす影響について研究しています。Eaglesfieldらによって膜タンパク質再構成効率を改善することが示されたプロテオロドプシンシグナルペプチドの効果について、PRSP-GluR0と表記されるGluR0の変異変異体を構築することで検討し、その天然シグナルペプチドを保有する野生型GluR0(以下、WT-GluR0)との発現と膜局在を比較する。このプロトコルは、逆エマルジョン法25 に基づいており、CFEカプセル化に対して堅牢になるように修正されている。提示された方法では、CFE反応は、最初に油中脂質溶液を使用して乳化され、CFEシステムを含み、脂質単分子膜によって安定化されるミクロンサイズの液滴が生成されます。次に、エマルジョン液滴は、別の脂質単層で飽和した油水界面の上に層状になります。次に、エマルジョン液滴は遠心力を介して油水界面を横切って移動するように強制されます。このプロセスを通じて、液滴は別の単層を獲得し、二重層脂質小胞を生成します。次に、CFE反応を含むGUVをインキュベートし、その間に膜タンパク質を発現させてGUV膜に取り込む。このプロトコルは、GluR0の無細胞発現のために指定されているが、他の膜タンパク質の無細胞合成や、細胞骨格再構成や膜融合研究26などの異なる合成細胞応用に用いることができる。

Protocol

この研究に使用した試薬と機器は、 資料表に記載されています。 1. 小さな単層小胞(SUV)の存在下でのバルクCFE反応 SUVの準備注:この手順は、クロロホルムの使用に関する安全指示に従って、ドラフト内で実行する必要があります。ガラスバイアルに5 mM 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)SUVを調製するには?…

Representative Results

CFE反応をカプセル化する前に、未変性シグナルペプチドとプロテオロドプシンシグナルペプチド(シグナルペプチド配列は 補足表1に示されています)を持つGluR0-sfGFPの2つのバリアントと可溶性sfGFPをバルク反応で個別に発現させ、プレートリーダーを使用してsfGFPシグナルを検出することによりそれらの発現をモニターしました(図2A)。).膜タンパ?…

Discussion

細胞シグナル伝達や細胞の興奮など、細胞膜を介した分子や情報の伝達に依存するほぼすべての細胞プロセスには、膜タンパク質が必要です。このように、膜タンパク質の再構成は、さまざまなアプリケーション向けのさまざまな合成細胞設計を実現する際の主要なボトルネックとなっています。従来の界面活性剤による生体膜中の膜タンパク質の再構成には、緩やかな膨潤や電気形成など?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

APLは、全米科学財団(EF1935265)、国立衛生研究所(R01-EB030031およびR21-AR080363)、および陸軍研究局(80523-BB)からの支援を認めています

Materials

100 nm polycarbonate filter STERLITECH 1270193
96 Well Clear Bottom Plate ThermoFisher Scientific 165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader Agilent 11-120-533
Creatine phosphate Millipore Sigma 10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit Yokogawa CSU-X1 
Density gradient medium (Optiprep) Millipore Sigma D1556 Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports Avanti 610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129 
Folinic acid calcium salt hydrate Millipore Sigma F7878
Glucose Millipore Sigma 158968
HEPES Millipore Sigma H3375
iXon X3 camera  Andor DU-897E-CS0 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1501
Light mineral oil Millipore Sigma M5904
Magnesium acetate tetrahydrate  Millipore Sigma M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) Avanti 610020
Olympus IX81 Inverted Microscope  Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective  Olympus 1-U2B933 
PEO-b-PBD Polymer Source P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA Homemade N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA Homemade N/A
POPC lipid in chloroform  Avanti 850457C
Potassium chloride Millipore Sigma P9541
PUREfrex 2.0 Cosmo Bio USA GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set New England BioLabs N0450
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs M0314S
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride Millipore Sigma S9888
Spermidine Millipore Sigma S2626
Sucrose Millipore Sigma S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 ELITechGroup VAPRO 5600

参考文献

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912 (2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236 (2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917 (2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. 生化学. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429 (2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104 (2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829 (2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells – current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332 (2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

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記事を引用
Loi, K. J., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System. J. Vis. Exp. (205), e66595, doi:10.3791/66595 (2024).

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