このプロトコルは、脂質二重層へのモデル膜タンパク質の合成および取り込みの研究のために、巨大単層小胞(GUV)内に無細胞発現(CFE)システムをカプセル化するために使用される逆エマルジョン法を説明しています。
無細胞発現(CFE)システムは、合成生物学における強力なツールであり、合成細胞におけるバイオセンシングやエネルギー再生などの細胞機能のバイオミミクリーを可能にします。しかし、広範囲の細胞プロセスを再構築するには、膜タンパク質を合成細胞の膜にうまく再構成する必要があります。可溶性タンパク質の発現は通常、一般的なCFEシステムで成功しますが、合成細胞の脂質二重層における膜タンパク質の再構成は困難であることが証明されています。本研究では、モデル膜タンパク質である細菌のグルタミン酸受容体(GluR0)を巨大単層小胞(GUV)に再構成する方法を、合成細胞内でCFE反応をカプセル化し、インキュベーションすることに基づいて、モデル合成細胞として紹介します。このプラットフォームを利用して、GluR0のN末端シグナルペプチドをプロテオロドプシンシグナルペプチドに置き換えることで、GluR0のハイブリッドGUVの膜への共翻訳転座の成功に対する効果が実証されます。この方法は、合成細胞中のさまざまな膜タンパク質を無細胞で再構成することを可能にする堅牢な手順を提供します。
ボトムアップ合成生物学は、バイオエンジニアリング、ドラッグデリバリー、再生医療など、数多くの応用が期待できる新興分野として、過去10年間で関心が高まっています1,2。特に、ボトムアップ合成生物学の礎石としての合成細胞の開発は、合成細胞の有望な応用と、in vitro生物物理学的研究を容易にするその細胞様の物理的および生化学的特性により、幅広い科学コミュニティを引き付けています3,4,5,6 .合成細胞は、多くの場合、細胞サイズの巨大単層小胞(GUV)で操作され、そこでさまざまな生物学的プロセスが再現されます。細胞細胞骨格の再構成7,8、光依存性エネルギー再生9、細胞コミュニケーション10,11、およびバイオセンシング12は、合成細胞における細胞様挙動を再構築するためになされた努力の例である。
一部の細胞プロセスは可溶性タンパク質に依存していますが、センシングやコミュニケーションなどの天然細胞の多くの特性は、イオンチャネル、受容体、トランスポーターなどの膜タンパク質を利用することがよくあります。合成細胞の発生における大きな課題は、膜タンパク質の再構成です。脂質二重層における膜タンパク質再構成の従来の方法は、界面活性剤を介した精製に依存していますが、このような方法は手間がかかり、発現宿主に毒性のあるタンパク質には効果がなく、GUVの膜タンパク質再構成には適していないことがよくあります13。
タンパク質発現の代替方法は、無細胞発現(CFE)システムです。CFEシステムは、細胞溶解物または精製転写翻訳装置14を用いて、さまざまなタンパク質のin vitro発現を可能にする合成生物学における強力なツールである。CFEシステムは、GUVにカプセル化することもでき、したがって、光収集合成細胞9または機械感受性バイオセンサー15,16の作成など、さまざまなアプリケーション向けにプログラム可能な区画化されたタンパク質合成反応を可能にする。組換えタンパク質発現法と同様に、CFEシステムでは膜タンパク質発現が困難です17。CFEシステムにおける凝集、ミスフォールディング、翻訳後修飾の欠如は、CFEシステムを用いた膜タンパク質合成の成功を妨げる主要なボトルネックです。CFEシステムを用いたボトムアップ膜タンパク質再構成の難しさは、シグナルペプチド、シグナル認識粒子、トランスロコン、シャペロン分子に依存する複雑な膜タンパク質生合成経路が存在しないことが一因です。しかし、最近では、翻訳中にミクロソームやリポソームなどの膜構造が存在すると、膜タンパク質の発現が成功することが複数の研究で示唆されています18,19,20,21。さらに、EaglesfieldらおよびSteinküherらは、シグナルペプチドとして知られる特定の疎水性ドメインを膜タンパク質のN末端に含めることで、その発現を有意に改善できることを発見した22,23。全体として、これらの研究は、合成細胞における膜タンパク質の再構成の課題は、タンパク質の翻訳がGUV膜の存在下で行われ、適切なN末端シグナルペプチドが利用されれば克服できることを示唆しています。
ここでは、GUVにおける膜タンパク質再構成のための組換え要素(PURE)CFE反応を用いたタンパク質合成のカプセル化のためのプロトコールを紹介します。モデル膜タンパク質として細菌のグルタミン酸受容体24 (GluR0)を選択し、そのN末端シグナルペプチドが膜再構成に及ぼす影響について研究しています。Eaglesfieldらによって膜タンパク質再構成効率を改善することが示されたプロテオロドプシンシグナルペプチドの効果について、PRSP-GluR0と表記されるGluR0の変異変異体を構築することで検討し、その天然シグナルペプチドを保有する野生型GluR0(以下、WT-GluR0)との発現と膜局在を比較する。このプロトコルは、逆エマルジョン法25 に基づいており、CFEカプセル化に対して堅牢になるように修正されている。提示された方法では、CFE反応は、最初に油中脂質溶液を使用して乳化され、CFEシステムを含み、脂質単分子膜によって安定化されるミクロンサイズの液滴が生成されます。次に、エマルジョン液滴は、別の脂質単層で飽和した油水界面の上に層状になります。次に、エマルジョン液滴は遠心力を介して油水界面を横切って移動するように強制されます。このプロセスを通じて、液滴は別の単層を獲得し、二重層脂質小胞を生成します。次に、CFE反応を含むGUVをインキュベートし、その間に膜タンパク質を発現させてGUV膜に取り込む。このプロトコルは、GluR0の無細胞発現のために指定されているが、他の膜タンパク質の無細胞合成や、細胞骨格再構成や膜融合研究26などの異なる合成細胞応用に用いることができる。
細胞シグナル伝達や細胞の興奮など、細胞膜を介した分子や情報の伝達に依存するほぼすべての細胞プロセスには、膜タンパク質が必要です。このように、膜タンパク質の再構成は、さまざまなアプリケーション向けのさまざまな合成細胞設計を実現する際の主要なボトルネックとなっています。従来の界面活性剤による生体膜中の膜タンパク質の再構成には、緩やかな膨潤や電気形成など?…
The authors have nothing to disclose.
APLは、全米科学財団(EF1935265)、国立衛生研究所(R01-EB030031およびR21-AR080363)、および陸軍研究局(80523-BB)からの支援を認めています
100 nm polycarbonate filter | STERLITECH | 1270193 | |
96 Well Clear Bottom Plate | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader | Agilent | 11-120-533 | |
Creatine phosphate | Millipore Sigma | 10621714001 | |
CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | CSU-X1 | |
Density gradient medium (Optiprep) | Millipore Sigma | D1556 | Optional to switch with sucrose in inner solution |
Filter supports | Avanti | 610014 | |
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Folinic acid calcium salt hydrate | Millipore Sigma | F7878 | |
Glucose | Millipore Sigma | 158968 | |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | |
iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Millipore Sigma | G1501 | |
Light mineral oil | Millipore Sigma | M5904 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Millipore Sigma | M5661 | |
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand) | Avanti | 610020 | |
Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olympus | 1-U2B933 | |
PEO-b-PBD | Polymer Source | P41745-BdEO | |
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA | Homemade | N/A | |
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA | Homemade | N/A | |
POPC lipid in chloroform | Avanti | 850457C | |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P9541 | |
PUREfrex 2.0 | Cosmo Bio USA | GFK-PF201 | |
Ribonucleotide Solution Set | New England BioLabs | N0450 | |
RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs | M0314S | |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit | BR1401801 | |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | |
Spermidine | Millipore Sigma | S2626 | |
Sucrose | Millipore Sigma | S0389 | |
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600 | ELITechGroup | VAPRO 5600 |