概要

糖尿病および骨粗鬆症のラット脛骨モデルに対する外科的骨移植技術

Published: July 05, 2024
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概要

ラットモデルへのインプラントの配置は、臨床研究に不可欠な実験的手順です。この研究では、糖尿病と骨粗鬆症のラットモデルの脛骨にチタンインプラントを埋め込むための包括的な外科的プロトコルを提示します。

Abstract

ラットは、インプラント歯科および整形外科、特に生体材料と骨組織との間の相互作用の研究において、貴重な動物モデルとして長い間役立ってきました。ラットの脛骨は、薄い組織層(皮膚と筋肉)を介した外科的アクセスが容易で、内側の顔の平らな形状により、骨内デバイスの外科的挿入を容易にするため、頻繁に選択されます。さらに、このモデルでは、さまざまな臨床状態を模倣して、形状、表面テクスチャ、生物学的手がかりなどのさまざまなインプラント条件に対する生物学的反応を評価することで、特定の疾患の誘発が可能になります。ただし、その堅牢な皮質構造にもかかわらず、特定の骨内デバイスでは、移植を成功させるためにデザインとサイズの適応が必要になる場合があります。したがって、インプラント領域の軟組織と硬組織の両方を操作するための標準化された外科的方法を確立することは、特にインプラント歯科や整形外科などの分野で、インプラントまたはスクリューデバイスの適切な配置を確保するために不可欠です。この研究では、80匹のSprague Dawleyラットを、それぞれの疾患に基づいて2つのグループに分けました:骨粗鬆症のグループ1と2型糖尿病のグループ2。移植は4週目と12週目で行われ、同じ外科医が一貫した手術技術に従っていました。肯定的な生物学的反応が観察され、配置されたすべてのインプラントの完全なオッセオインテグレーションが示されました。これらの結果は、外科的プロトコルの成功を検証し、他の研究で再現し、生体材料コミュニティのベンチマークとして役立つことができます。特に、オッセオインテグレーションの値は、両方の疾患モデルで4週間と12週間の両方で安定しており、インプラントの長期にわたる持続的な統合を示し、4週間という早い時期に親密な骨接続が確立されることを強調しています。

Introduction

実験対象としてラットが一般的に選択されるのは、ラットが繁殖が容易で、大型の動物モデルに比べて比較的安価であるという事実によるものです。骨粗鬆症や糖尿病などの障害の信頼性の高い再現などの新しい手順の出現により、このモデルは、治療の潜在的な使用および/または薬物および手術装置または手順に対する生物学的応答における疾患の影響を分析するのに特に有用になります1,2

ラットの骨量増加は、主に生後6か月の間に発生しますが、一部の研究者は、長骨が少なくとも1年間は絶えず成長し、長さが徐々に増加すると考えています1。加齢に伴い、モデリングからリモデリングへの移行がありますが、これは骨全体ですべての場合に等しく発生するわけではありません2。雌のSprague Dawleyラットは、雄のラットよりも成長が遅く、雄のラットよりも体重のピークが低くなります1。ラットの継続的な骨伸長と多様な骨リモデリングダイナミクスは、人間の健康問題に対処する際に考慮しなければならない要素です。しかし、生涯にわたるラットの骨の発達や、種が骨1を再構築できないことを示す実験的研究はまだ見つかっていません実験が生後約10か月で開始された場合、この縦方向の骨の成長により、脛骨の成長板から少なくとも1 mmのマージンはそのまま残されるべきであり、歯科インプラント研究で考慮すべき問題です2。ホルモンは骨研究の重要なパラメータでもあります。生後8か月の時点で、雄ラットは脛骨の雌よりも骨幅が22%大きく、破壊強度が33%大きいことがわかりました3。

したがって、整形外科用スクリューまたは歯科インプラントのオッセオインテグレーションは、骨へのデバイス埋め込みに対する全身反応に影響を与える多数の要因に依存する複雑なプロセスであるため、整形外科およびインプラント歯科では、障害の信頼性の高い再現が非常に重要です。骨粗鬆症や糖尿病などの全身性疾患は、整形外科やインプラント歯科の成功率に影響を与えることが知られているため、ラットモデルでこれらの障害を確実に再現することで、これらの制限を克服する方法を探求することができます。

ラットの脛骨は、外科的アクセスが容易で、骨量が適度で、内側プレート上の平らな形状により、外科的骨移植実験4,5に適しており、インプラント表面がオッセオインテグレーションに及ぼす影響を調査する多数の調査研究で使用されてきました4,5,6.健康な動物7と糖尿病または骨粗鬆症に罹患した罹患動物8,9,10,11,12,13,14の両方で、インプラント表面に添加されたコーティングおよび物質のオッセオインテグレーションへの影響を評価する研究が増えています。

1匹のラットの脛骨に埋め込むインプラントデバイスの数は限られており、研究の種類によって異なる場合があります。インプラントの数や研究条件に応じて、外科的外傷を最小限に抑えるようにデバイスの寸法を調整する必要があります。1つのインプラントを用いた研究では、ほぼ人間サイズのインプラント(直径2.0mm、長さ4〜5mm)を埋入することができ、両皮質固定を達成することができます6,7,15,16。マルチインプラントプロトコルのインプラントの寸法は、適切なインプラントサイズ(直径1.5mm、長さ2.5mm)4,17を採用する必要があります。

本研究は、骨粗鬆症と糖尿病ラットモデルの 2 つのラットモデルの脛骨にチタンインプラントを埋入するための標準化された外科プロトコルを説明することを目的としています。さらに、この研究では、さまざまなタイプのインプラント表面の生体機能化とそのオッセオインテグレーションへの影響を評価するための外科的プロトコルのテストが可能になります。

80匹のラットのサンプルを2つのグループに分けました。グループ1では、卵巣摘出されたSprague Dawleyの雌40匹と偽動物5匹が選択され、平均体重は484g、平均年齢は12週齢でした。ベンダーの推奨( 材料表を参照)に基づき、去勢手術の3か月後に実験が開始されました。この待機期間により、性ホルモンの消失が確実になりました。骨粗鬆症は、マイクロコンピューター断層撮影法(マイクロCT)骨分析に基づいて手術時に確認され、偽群と比較して平均20%の骨量減少を反映しています。グループ2は、II型糖尿病の40匹のBBDR(Bio Breeding Diabetes Resistance)遺伝子組み換えSprague Dawleyラットで構成されていました。平均体重は730g、平均年齢は12週であった。手術前に、糖尿病の状態は 3 日間連続して血糖値を測定し、結果は 200 mg/dL を超えました。グルコースは、空腹時6時間にグルコメーターで測定され、尾部穿刺によって血滴が採取されました。

長さ2mm、直径1.8mmのグレード3チタンインプラントを使用しました。すべてのインプラントは、シクロヘキサン(2分間に3回)、アセトン(1分間に1回)、脱イオン水(2分間に3回)、エタノール(2分間に3回)、およびアセトン(2分間に3回)で超音波洗浄することにより、クリーンルーム条件で滅菌しました超音波浴(230VAC、50/60Hz、360W)。その後、試料を窒素ガスで乾燥させ、0.5バールの窒素ビームを直接試料に印加しました。移植に先立ち、インプラントをまず脱イオン水に浸し、次に70%エタノール(v/v)に10分間浸漬しました。この後、インプラントを滅菌マイクロ遠心チューブに移し、手術まで滅菌状態に保たれました。

Protocol

すべての実験手順は、スペインの法律(Royal Decree 53/2013)およびGeneralitat de Catalunya規則(Decree 214/97)で実施されている、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州共同体ガイドライン(Directive 2010/63/EU)に従って実施されました。すべての動物処置および取り扱いに関する倫理承認は、Vall D’Hebron Institut de Recerca(登録番号72/18 CEEA)の動物実験倫理委員会から取得されまし?…

Representative Results

外科的段階この研究で使用された両方の動物モデルには、誘発された疾患による特定の制約があることに言及することが重要です。硬組織と軟組織の操作に関するこれらの制約は、外科的処置中に反映されます。 糖尿病モデルでは、ラットの方が大きいため、外科的処置中に脚を安定させることが難しくなっています。これによ?…

Discussion

ラットはオッセオインテグレーションの研究に広く使用されているモデルですが、インプラントを適切に配置するための再現可能な外科的手法を定義して説明することが重要です。このような手法は、科学界のガイドとして役立つ可能性があります。さらに、骨粗鬆症や糖尿病などの特定の疾患が骨代謝を変化させるという事実は、外科的処置を正しく設計すること…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、プロジェクトPID2020-114019RBI00およびPID2021-125150OB-I00を通じて財政支援を提供してくれたスペイン国立研究機関に感謝します。

Materials

22 G needles+A2:C30 Terumo NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes Braun 4617100V-02 4606051V
Adson forceps Antão Medical Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats Janvier Labs
Betadine Mylan
Buprecare Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder Antão Medical Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight Antão Medical AMA603 / AMA600
Electric shaver Oster Pro 3000i 34264482227
Extra Fine Graefe Forceps F.S.T Ref: 11150-10
Gauze pads COVIDIEN 441001
Glucometer Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm soadco Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm soadco Ref. OS-3
Isoflo Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS) soadco Ref. 10 02 01 T
Latex gloves – Surgical gloves sterile Hartmann Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette Antão Medical Ref: AMA940-3
Metacam Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight nopa Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT ) Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4 Antão Medical Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation Hygitech Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C Razor Med Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs Alledental Ref: 270712
Sterile Irrigation system Hygitech Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal) Dinarex 4410
Surgical contra-angle handpiece W&H Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece W&H SN 08877
Surgical contra-angle handpiece W&H SN 01309
Surgical Electric Motor WH Implantmed Type: SI-1023  Ref: 30288000
Surgical scalpel handle AsaDental Ref: 0350-3
Towel clamps Xelpov surgical AF-773-11
Ultrasonic device J.P. Selecta, Abrera, Spain

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記事を引用
Alfaiate, D., Mas-Moruno, C., Manuela, C., Ustrell, J. M., Camara, J. A., Ferrer, M., Manero, J. M., Manzanares-Céspedes, M. Surgical Bone Implantation Technique for Rat Tibia Models of Diabetes and Osteoporosis. J. Vis. Exp. (209), e66591, doi:10.3791/66591 (2024).

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