概要

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

Published: May 24, 2024
doi:

概要

このプロトコルでは、網膜光受容体末の構造的特徴に焦点を当てて、体積電子顕微鏡用の網膜サンプルを調製するための詳細な手順について説明します。

Abstract

体積電子顕微鏡(Volume EM)は、細胞や組織の3D構造をナノメートルレベルの精度で視覚化するための強力なツールとして登場しました。網膜内では、さまざまな種類のニューロンが内叢状層と外叢状層にシナプス接続を確立しています。従来のEM技術は、網膜細胞内小器官に関する貴重な洞察をもたらしてきましたが、その限界は2D画像データの提供にあり、正確な測定を妨げる可能性があります。例えば、シナプス伝達に不可欠な3つの異なるシナプス小胞プールのサイズを定量化することは、2Dでは困難です。Volume EMは、大規模で高解像度の3Dデータを提供することでソリューションを提供します。サンプル調製はボリュームEMの重要なステップであり、画像の鮮明度とコントラストに大きな影響を与えることは注目に値します。これに関連して、網膜の視細胞軸索終末の3D再構築のためのサンプル調製プロトコルを概説します。このプロトコルには、網膜の解剖と固定、サンプルの埋め込みプロセス、および関心領域の選択という3つの主要なステップが含まれています。

Introduction

網膜には、ニューロンの軸索と樹状突起が絡み合って密集しており、それらの間にシナプスを形成しています1。顕微鏡検査は、微細で複雑で小さな構造を持つ網膜の解剖学を研究するために不可欠なツールです。電子顕微鏡(EM)は、細胞内小器官の超微細構造や特定のタンパク質の正確な局在をナノメートルレベル2で調査するための比類のない能力を提供しますが、2次元(2D)平面に限定された画像を生成するため、重要な情報が失われる可能性があります。

新しい高解像度体積電子顕微鏡(ボリュームEM)技術の開発は、より包括的で大規模な3次元(3D)構造情報の提供をサポートします。一部の3D EM手法は、最近、他の手法によってレビューされました3,4,5。3D EMは、ニューロンの形状と接続性の詳細の再構築を可能にし、関心のある構造の正確な定量分析を可能にします。これは、ボリュームEMによって取得されたデータが、より体系的で、完全で、正確であることを示しています。

視覚シグナル伝達6,7の初期ニューロンを構成する網膜光受容体は、光受容体の末端に二次双極細胞および水平細胞の樹状突起とシナプスを確立し、興奮性シグナル8,9を促進する。これらの末端は、円錐茎および桿体スフェルールと呼ばれ、ミトコンドリア、シナプスリボン、シナプス小胞の3つの重要なコンポーネントを包含しています。これまでの研究は主にリボンシナプスの一般的な構造に集中していましたが、ミトコンドリア、リボン、小胞プールなどの主要成分の微細構造、およびターミナル10,11,12,13の空間構成に関する調査は著しく欠如していました.各成分を精密かつ系統的に解析し、視細胞末端におけるそれらの相互関連を理解することは、空間構成を解き明かし、視覚処理機能を包括的に把握するために不可欠です。視細胞では、ミトコンドリアは主に内部セグメント、細胞体、および末端に存在します。ここでは、光受容体末端のミトコンドリアに着目しました。集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)は、高分解能(x、y、z分解能<5nm)と比較的大きな体積磁束4,14を誇る体積EMの一種であり、感光器端末の3D構造を正確に視覚化するための強力なツールとして位置付けられています。

FIB-SEMとシリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡(SBF-SEM)は、サンプルの表面をスキャンして組織の画像を取得するためのSEMに基づくボリュームEMです。試料表面の超微細構造的特徴は、電子ビームが試料15をスキャンするときの二次電子または後方散乱電子(BSE)の強度によって生じるコントラストによって明らかにされる。基本的に、SEMで樹脂包埋組織サンプルの断面表面からBSEまたは二次電子を検出することで、包埋サンプル16,17の画像を取得することができる。BSEや二次電子の生成が少ない場合、試料表面の情報しか得られません。一貫したコントラストと高品質の連続画像を実現するには、サンプル中に重金属を十分に堆積させる必要があります。したがって、特定のサンプル調製プロトコルは、その後のセグメンテーション、3D再構成、およびSEMをシリアルイメージングに利用する際の分析に不可欠です。オスミウム-チオカルボヒドラジド-オスミウム(OTO)法は、生体試料の3D電子顕微鏡法の典型的な試料調製スキームであり、脂質含有膜の構造を維持し、良好なコントラストを維持する18,19

ここでは、ボリュームEMを使用するためのレチナールサンプルの調製のためのOTO法を開発しました。このプロセスは、特に網膜の解剖、網膜組織の最適な固定時間の決定、3Dサンプル調製における特定の手順と注意事項の詳細に焦点を当てています。さらに、ターゲット構造のセグメンテーションと3D再構成は、この拡張アプリケーションに不可欠なステップです。網膜は小さくて材料を得るのが難しい構造であるため、EMには迅速かつ正確な操作が必要であり、決まった時間とすぐに使用できる新鮮な試薬が準備されています。

Protocol

動物の世話と使用のプロトコルは、温州医科大学の倫理委員会によって承認され、視覚眼科研究協会(ARVO)によって確立されたガイドラインに従っていました。すべてのマウスを12時間のライトサイクルと12時間のダークサイクルで維持し、標準的なチャウ食餌を与えました。 1. 網膜の解剖と固定 マウス(C57BL / 6J、雄、8週齢、20…

Representative Results

図1A は、従来の化学的二重固定法を用いて調製した網膜視細胞終末の像を示し、 図1B は、OTO法を用いて調製した網膜光受容体終末の像を示す。どちらもFIB-SEMでサンプリングしました。OTO法を用いることで細胞膜構造を極力保持でき、小胞の輪郭まで鮮明に見えることがよくわかります。また、OTO法を用いて得られる画像?…

Discussion

私たちは、網膜組織における光受容体の末端構造を分析するために、OTOのボリュームEMサンプル調製プロトコルを実装しました。焦点は、網膜の剥離と固定から始まり、視細胞軸索終末の3D再構成の結果を示すことまで、手順全体を詳細に説明することでした。

網膜組織の特徴は、脳組織とは異なり、地域差がないことです。網膜は、3層のニュ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究の一部は、National Key Research and Development Program of China(2022YFA1105503)、State Key Laboratory of Neuroscience(SKLN-202103)、Zhejiang Natural Science Foundation of China(Y21H120019)の助成を受けて行われました。

Materials

2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402
Acetone Electron Microscopy Science 10000
Amira 6.8 Thermo Fisher Scientific
CaCl2 Sigma C-2661
Embedding mold Beijing Zhongjingkeyi Technology GP10590
Epon resin Electron Microscopy Science 14900
Ethanol Sigma 64-17-5
Glutaraldehyde Electron Microscopy Science 16020
Helios NanoLab 600i dual-beam SEM FEI
L-aspartic acid Sigma 56-84-8
Lead nitrate Sigma 10099-74-8
Na2HPO4.12H2O Sigma 71650 A component of phosphate buffer
NaH2PO4.H2O Sigma 71507 A component of phosphate buffer
OsO4 TED PELLA 4008-160501
Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 157-8
Potassium ferrocyanide Sigma 14459-95-1
Sodium cacodylate Sigma 6131-99-3
Sputter coater Leica ACE200
Thiocarbohydrazide Sigma 2231-57-4
Uranyl acetate TED PELLA CA96049

参考文献

  1. Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
  2. Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
  3. Varsano, N., Wolf, S. G. Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions. Curr Opin Struct Biol. 76, 102444 (2022).
  4. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Sterling, P., Matthews, G. Structure and function of ribbon synapses. Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).
  7. Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).
  8. Thoreson, W. B. Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina. Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).
  9. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  10. Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).
  11. Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons. J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).
  12. Zampighi, G. A., et al. Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion. PLoS One. 6 (3), e16944 (2011).
  13. Barnes, S., et al. Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs. Plos One. 11 (3), e0150024 (2016).
  14. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, e25916 (2017).
  15. Crewe, A. V., Lin, P. S. The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope. Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).
  16. Richards, R. G., Gwynn, I. A. Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy. J Microsc. 177, 43-52 (1995).
  17. Wergin, W. P., et al. Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope. Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).
  18. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).
  19. Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy. Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).
  20. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  21. Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits. Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Front Neural Circuits. 12, 98 (2018).
  23. Guo, J., et al. An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM. J Struct Biol. 212 (1), 107600 (2020).
  24. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH). J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).

Play Video

記事を引用
Zhao, W., Yang, Q., Lai, X., Zhang, J. Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (207), e66589, doi:10.3791/66589 (2024).

View Video