このプロトコルは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)の培養や上清の収集から、超遠心分離を使用した細胞外小胞(EV)の抽出まで、すべての手順を説明しています。
ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)は、さまざまな組織や臓器の再生と再構築を促進することができます。最近の研究では、それらの再生機能は、細胞間接触と細胞パラクリン効果に起因する可能性があることが示唆されています。パラクリン効果は、細胞が短距離で相互作用し、情報を伝達するための重要な方法であり、細胞外小胞(EV)がキャリアとしての機能的役割を果たします。ADSC EVは、再生医療に大きな可能性を秘めています。これらの方法の有効性については、複数の研究で報告されています。現在、EVを抽出および単離するためのさまざまな方法が、遠心分離、沈殿、分子サイズ、親和性、マイクロ流体工学などの原理に基づいて説明されています。超遠心分離は、EVを分離するためのゴールドスタンダードと見なされています。それにもかかわらず、超遠心分離中の予防措置を強調するための細心の注意を払ったプロトコルはまだ存在しません。この研究では、ADSC培養、上清収集、およびEV超遠心分離に関与する方法論と重要なステップを示します。しかし、超遠心分離は費用対効果が高く、さらなる治療を必要としないにもかかわらず、回収率が低い、EVが凝集するなど、避けられない欠点がいくつかあります。
ほとんどのADSCは脂肪組織に由来し、心筋、骨、皮膚など、さまざまな組織や臓器の再生と再建を促進することが実証されています1。最近の研究では、ADSCの再生機能は、細胞間接触と細胞のパラクリン効果によるものである可能性が示唆されています2。パラクリン効果は、細胞が短距離で相互作用し、情報を伝達するための重要な手段であり、この機能は細胞外小胞(EV)を介して達成されます。
EVは、細胞が作り出す二重膜構造で、直径は40nmから160nm(平均約100nm)です。それらは、サイトカイン産生、細胞増殖、アポトーシス、代謝など、さまざまな細胞機能に影響を及ぼします3,4。ADSC EVの機能については、骨再生の促進、口腔粘膜組織の再生、組織移植後の脂肪組織の生存、皮膚創傷修復など、数多くの研究が行われてきた5,6,7,8。ADSC EVの再生医療における大きな可能性は明らかです。上清からEVを抽出し分離するには、遠心分離、沈殿、分子サイズ、親和性、マイクロ流体工学に基づく技術など、さまざまな方法が存在します。超遠心分離法は、EV9を分離するためのゴールドスタンダードと広く考えられています。EV分離のための超遠心分離の基本原理は、サンプル中の粒子の沈降係数が異なるため、粒子が沈降し、異なる分離層に凝集するという事実に基づいています。しかし、超遠心分離時の注意点を強調した詳細なプロトコルは未だ確立されていません。
したがって、この研究では、ADSC培養、上清収集、およびEVの超遠心分離手順と重要なポイントを、情報の論理的な流れと明確で形式的な言語を使用して客観的に概説します。これは、将来の実験の貴重な参考資料となります。
正式な実験プロセスでは、最良の実験結果を得るためにいくつかのポイントが重要です。私たちの以前の経験に基づいて、可能な限り最高の細胞状態を保証するため、継代3-6 ADSCを選択することをお勧めします。P3より前は、赤血球、内皮細胞、およびその他の雑多な細胞がスクリーニングされていなかった可能性があります。P6以降、細胞は徐々に老化する可能性があり、分泌されたEVの状?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、中国国家自然科学基金会(82202473)の支援を受けて行われました。
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane | Acros Organics | 4652 | 0.22 μm |
Basal Medium For Cell Culture | OriCell | BHDM-03011 | |
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells) | OriCell | HUXMD-05002 | |
Inverted Microscope | OLYMPUS | Lx70-S8F2 | |
Low Speed Centrifuge | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd. | SC-3612 | |
Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | |
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x) | Solarbio | P1410 |