チオフェネスルホンアミド化合物は、 ビブリオ クォーラムセンシングレギュレーターLuxR/HapRの強力で特異的な阻害剤であり、 in vivoでの活性を阻害し、病原性、運動性、およびバイオフィルムの遺伝子の転写を防ぎます。このプロトコールでは、これらの化合物がどのように合成され、 in silicoでモデル化され、in vivo でLuxR/HapRに対する活性がアッセイされるかについて詳しく説明します。
細菌は、細菌の行動を制御するために広く利用されている細胞間コミュニケーションの方法であるクォーラムセンシングを使用して、局所的な集団数を検出します。 ビブリオ 種では、マスタークオラムセンシングレギュレーターであるLuxR/HapRが数百のクオラムセンシング遺伝子を制御しており、その多くは病原性、代謝、運動性などに影響を与えます。チオフェネスルホンアミドは、LuxR/HapRの強力な阻害剤であり、これらの転写因子のリガンドポケットに結合し、下流のクォーラムセンシング遺伝子発現を阻害します。このクラスの化合物は、大学生がCUREモデルを使用して化学と生物学のスキルを吸収するための、シンプルで堅牢で教育的な一連の手順の開発の基礎として機能しました。(1)チオフェネスルホンアミドコアに基づく新しい低分子阻害剤の設計と合成、(2)構造モデリングを使用してターゲットへの結合親和性を予測し、(3)特定の Vibrio LuxR/HapRタンパク質に対する微生物学的アッセイで化合物の有効性をアッセイする、反復的かつ学際的なプラットフォームでの3つの学習段階を含む最適化されたプロトコルが説明されています。 記載されている大腸菌 で実施されたレポーターアッセイは、天然 のビブリオ 種における標的タンパク質に対する化合物の有効性を首尾よく予測する。
細菌は、クオラムセンシング(QS)1と呼ばれる細胞間コミュニケーションプロセスを使用して、集団密度と近くの細胞の種類を感知します。細菌の多様なクレードは、QSを使用して、運動性、バイオフィルム形成、病原性因子分泌などのさまざまな行動を制御します。QSに関与するタンパク質とシグナルは、細菌によって大きく異なります。 ビブリオ 種では、QSシグナル伝達系は主に、自己誘導物質2 と呼ばれる特定の同族の低分子シグナルを認識する膜結合ハイブリッドヒスチジン-キナーゼ受容体を使用します2(図1)。これらの受容体は、システム内を流れるリン酸塩から、低分子RNAを転写する応答調節因子への流れを制御します。sRNAの産生は、LuxR/HapR3と総称される保存されたタンパク質群として定義されるマスタークォーラムセンシングレギュレーターの産生を変化させます。したがって、低細胞密度では、LuxR/HapRをコードするmRNAはsRNAターゲティングによって分解され、高細胞密度では、LuxR/HapRタンパク質が最大レベルで産生されます(Ball et al.3でレビュー)。
タンパク質のLuxR/HapRグループは、DNA結合ドメインにヘリックスターンヘリックスが存在すること、機能的なホモダイマーの形成、および典型的にはリガンド結合ドメイン4の包含によって定義されるTetRタンパク質の大きなグループに属します。Vibrio LuxR/HapRタンパク質は、これらの基準すべてに適合していますが、リガンドはまだ特定されていません。研究されたすべてのビブリオ種に含まれるLuxR/HapRタンパク質は、バイオフィルム、プロテアーゼ、細胞毒素、溶血素、III型分泌物、VI型分泌複合体などの病因に重要であることが知られている多数の下流挙動を制御しています3。LuxR/HapRタンパク質の欠失は、宿主系5,6,7の病原性の低下または喪失につながり、これらのタンパク質の阻害が疾患の進行を抑制するための実行可能な戦略であるという仮説につながる。ビブリオ種は、魚、貝類、サンゴなどの海洋生物だけでなく、特定の種に接触したり摂取したりする人間にもビブリオ症を引き起こします。
これまでの研究では、複数のビブリオ種において、LuxR/HapRタンパク質のリガンド結合ドメインに特異的に結合し、その機能を阻害するチオフェネスルホンアミド化合物のパネルが同定されています5,8,9(図1)。大腸菌のレポータースクリーニングを用いて、化合物を同定し、続いて天然のビブリオで試験したところ、異種大腸菌の効果とビブリオ9の有効性との間に高い相関関係が示されました。これらの化合物は、1ステップで簡単に合成できるため、ケミカルバイオロジーラボコースのコンテキストでの小さなライブラリ合成に最適です。この分子の足場を中心に設計された3週間のコースベースの学部研究体験(CURE)は、以前に報告されています8。この3週間のモジュールは、多様なビブリオ種におけるLuxR/HapRタンパク質の阻害を標的とするように設計されたこの1年間のCUREで、さらに最適化、合理化、拡張されています。
このCUREはもともと、2段階、3週間の短縮プロトコル(設計/合成およびアッセイ)として開発され、上位レベルの有機実験室コース8の一部として5学期に実施されました。最初のレポートから、コンピューターモデリングモジュールが追加され、 大腸菌 アッセイは初心者の研究者向けに最適化されました。その結果、インディアナ大学のArts and Sc…
The authors have nothing to disclose.
本書で報告された研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の国立総合医科学研究所(National Institute of General Medical Sciences)の支援を受け、JVKに授与された第R35GM124698号です。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
2-thiophensulfonyl chloride | Ambeed | A258464 | |
3-Phenyl-1H-pyrazole | Ambeed | A104401 | 98% |
96-well clear bottom black plates | USA Scientific | 5665-5090Q | 96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case |
Autodock Tools | http://mgltools.scripps.edu/downloads | ||
Autodock Vina | https://vina.scripps.edu | ||
Chloramphenicol | |||
DMSO | |||
ethyl acetate | Fisher Scientific | AA31344M4 | Reagent grade |
hexanes | Fisher Scientific | H291 | |
Kanamycin | |||
magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | Anhydrous |
Microporous Film | USA Scientific | 2920-1010 | Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized |
molview | molview.org | ||
NaCl | |||
Protein Databank | https://www.rcsb.org/ | ||
Pymol | https://pymol.org/2/ | ||
Qualitative filter paper | Fisher Scientific | 09-805-342 | Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm |
Silica gel | Sorbtech | 30930M-25 | Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh) |
Sodium hydride | Millipore Sigma | 452912 | 60 % dispersion in mineral oil |
Tetrahydrofuran | Fisher Scientific | MTX02847 | Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv |
TLC Plates | Sorbtech | 1634067 | Silica gel TLC plates, aluminum backed |
Tryptone | |||
webina | https://durrantlab.pitt.edu/webina/ | ||
Yeast Extract |