概要

ビブリオクォーラムセンシング阻害剤の合成とアッセイ

Published: May 31, 2024
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概要

チオフェネスルホンアミド化合物は、 ビブリオ クォーラムセンシングレギュレーターLuxR/HapRの強力で特異的な阻害剤であり、 in vivoでの活性を阻害し、病原性、運動性、およびバイオフィルムの遺伝子の転写を防ぎます。このプロトコールでは、これらの化合物がどのように合成され、 in silicoでモデル化され、in vivo でLuxR/HapRに対する活性がアッセイされるかについて詳しく説明します。

Abstract

細菌は、細菌の行動を制御するために広く利用されている細胞間コミュニケーションの方法であるクォーラムセンシングを使用して、局所的な集団数を検出します。 ビブリオ 種では、マスタークオラムセンシングレギュレーターであるLuxR/HapRが数百のクオラムセンシング遺伝子を制御しており、その多くは病原性、代謝、運動性などに影響を与えます。チオフェネスルホンアミドは、LuxR/HapRの強力な阻害剤であり、これらの転写因子のリガンドポケットに結合し、下流のクォーラムセンシング遺伝子発現を阻害します。このクラスの化合物は、大学生がCUREモデルを使用して化学と生物学のスキルを吸収するための、シンプルで堅牢で教育的な一連の手順の開発の基礎として機能しました。(1)チオフェネスルホンアミドコアに基づく新しい低分子阻害剤の設計と合成、(2)構造モデリングを使用してターゲットへの結合親和性を予測し、(3)特定の Vibrio LuxR/HapRタンパク質に対する微生物学的アッセイで化合物の有効性をアッセイする、反復的かつ学際的なプラットフォームでの3つの学習段階を含む最適化されたプロトコルが説明されています。 記載されている大腸菌 で実施されたレポーターアッセイは、天然 のビブリオ 種における標的タンパク質に対する化合物の有効性を首尾よく予測する。

Introduction

細菌は、クオラムセンシング(QS)1と呼ばれる細胞間コミュニケーションプロセスを使用して、集団密度と近くの細胞の種類を感知します。細菌の多様なクレードは、QSを使用して、運動性、バイオフィルム形成、病原性因子分泌などのさまざまな行動を制御します。QSに関与するタンパク質とシグナルは、細菌によって大きく異なります。 ビブリオ 種では、QSシグナル伝達系は主に、自己誘導物質2 と呼ばれる特定の同族の低分子シグナルを認識する膜結合ハイブリッドヒスチジン-キナーゼ受容体を使用します2(図1)。これらの受容体は、システム内を流れるリン酸塩から、低分子RNAを転写する応答調節因子への流れを制御します。sRNAの産生は、LuxR/HapR3と総称される保存されたタンパク質群として定義されるマスタークォーラムセンシングレギュレーターの産生を変化させます。したがって、低細胞密度では、LuxR/HapRをコードするmRNAはsRNAターゲティングによって分解され、高細胞密度では、LuxR/HapRタンパク質が最大レベルで産生されます(Ball et al.3でレビュー)。

タンパク質のLuxR/HapRグループは、DNA結合ドメインにヘリックスターンヘリックスが存在すること、機能的なホモダイマーの形成、および典型的にはリガンド結合ドメイン4の包含によって定義されるTetRタンパク質の大きなグループに属します。Vibrio LuxR/HapRタンパク質は、これらの基準すべてに適合していますが、リガンドはまだ特定されていません。研究されたすべてのビブリオ種に含まれるLuxR/HapRタンパク質は、バイオフィルム、プロテアーゼ、細胞毒素、溶血素、III型分泌物、VI型分泌複合体などの病因に重要であることが知られている多数の下流挙動を制御しています3。LuxR/HapRタンパク質の欠失は、宿主系5,6,7の病原性の低下または喪失につながり、これらのタンパク質の阻害が疾患の進行を抑制するための実行可能な戦略であるという仮説につながる。ビブリオ種は、魚、貝類、サンゴなどの海洋生物だけでなく、特定の種に接触したり摂取したりする人間にもビブリオ症を引き起こします。

これまでの研究では、複数のビブリオ種において、LuxR/HapRタンパク質のリガンド結合ドメインに特異的に結合し、その機能を阻害するチオフェネスルホンアミド化合物のパネルが同定されています5,8,9(図1)。大腸菌のレポータースクリーニングを用いて、化合物を同定し、続いて天然のビブリオで試験したところ、異種大腸菌の効果とビブリオ9の有効性との間に高い相関関係が示されました。これらの化合物は、1ステップで簡単に合成できるため、ケミカルバイオロジーラボコースのコンテキストでの小さなライブラリ合成に最適です。この分子の足場を中心に設計された3週間のコースベースの学部研究体験(CURE)は、以前に報告されています8。この3週間のモジュールは、多様なビブリオ種におけるLuxR/HapRタンパク質の阻害を標的とするように設計されたこの1年間のCUREで、さらに最適化、合理化、拡張されています。

Protocol

本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。 1. チオフェネスルホンアミドライブラリーの設計と合成 注:3-フェニル-1-(チオフェン-2-イルスルホニル)-1H-ピラゾール(PTSP)などのチオフェネスルホンアミド阻害剤は、図2に示すように、ワンステップ塩基促進縮合8,9を介して合成されます。研究用の新しい化合物ライブラリーを設計するには、研究者は適切なアミンと塩化スルホニルを調達し、以下に要約する手順に従う必要があります。アミンの構造が芳香族ピラゾール誘導体と大きく異なる場合は、文献を検索して別の反応条件を特定する必要があるかもしれません。この手順は頑健であり、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、ピリジンなどの塩基もうまく機能しています。これがコースで行われる場合、学生は自分自身の手順を選択する自由を与えられる可能性があり、好ましい結果が得られる可能性があります。 PTSPの合成と単離注:これは、3時間のラボ期間1回で完了できます。822 mgのフェニルピラゾール(5.7 mmolのアミン、1.5 eq.)を15 mLのテトラヒドロフランに溶かし、50 mLの丸底フラスコに攪拌子を付けて溶解します。. 306 mgの水素化ナトリウム(油中60%、7.65 mmol、2等式)をゆっくりと加えて懸濁液を作成します。この懸濁液を攪拌板上で10分間攪拌します。 バイアルに、塩化チオフェンスルホニル(塩化スルホニルの3.82mmol、1等式)の溶液を5mLのTHFに調製します。 ステップ1.1.2で調製した懸濁液にステップ1.1.3で調製した塩化スルホニルの溶液を加え、得られた懸濁液をさらに30分間撹拌します。 50 mLの丸底フラスコの反応混合物に20 mLの脱イオン水を加えます。 攪拌子を除く反応フラスコのすべての内容物を250mLのセパレーター漏斗10に移す。 セパリー漏斗に酢酸エチル(EtOAc)20mLを加えて振とうします。 最下層(水性)を取り除き、脇に置きます。 一番上の(有機)層を取り除き、200 mLの三角フラスコに入れておきます。. 水層を分離液漏斗に戻し、酢酸エチル20mLで抽出します。 手順 1.1.8 と 1.1.9 を繰り返します。 結合した有機層を分液漏斗に戻し、20 mLの飽和NaCl(ブライン)で洗浄します。 最下層(水性)を取り除き、脇に置きます。 一番上の(有機)層を三角フラスコに戻します。 三角フラスコでMgSO4上の結合有機層を乾燥させ、定性的な濾紙10を用いて250mLの丸底フラスコに濾過する。 ロータリーエバポレーターの有機溶剤を取り除きます。 粗反応混合物を 1HNMRで分析し、生成物が形成されていることを確認します10。注:このステップに必要な時間は、NMR分光法に対する学生の快適さのレベルによって異なります。 シリカゲルカラムクロマトグラフィー(10:1ヘキサン:酢酸エチル)10で製品を精製します。注:これは、3時間のラボ期間1回で完了できます。 製品を分光学的に特徴付けます。注:このステップに必要な時間は、NMR分光法に対する学生の快適さのレベルによって異なります。注:3-フェニル-1-(チオフェン-2-イルスルホニル)-1H-ピラゾール(PTSP)10の特性データ:1H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) : δ 8.11 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.88 – 7.79 (m, 3H), 7.68 (dd, J = 5.0, 1.4 Hz, 1H), 7.44 – 7.31 (m, 3H), 7.07 (dd, J = 5.0, 3.9 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.8 Hz, 1H).13C NMR(101 MHz、CDCl 3 ):δ 157.17、136.84、135.40、135.36、132.55、131.28、129.36、128.72、127.79、126.47、106.90。HRMS(ESI): C13H10O2N2NaS2 [M + Na +]について計算:313.0076。発見:313.0078。 2. チオフェンスルホンアミドのビブリオLuxR/HapR制御因子への結合を予測するための構造モデリング 注:このプロトコルは、Webina11 と呼ばれるAutoDock VinaのWebベースバージョンを使用して、 ビブリオバルニフィカス12のSmcRと呼ばれるLuxR/HapRホモログのリガンド結合ポケットに小分子阻害剤(この場合はPTSP)をドッキングします。このプロトコルの結果は、(1)計算された結合親和性、および(2)リガンド-タンパク質相互作用を視覚化するためにPyMolまたは関連プログラムで開くことができる構造ファイルです。このプロトコールは、リガンド結合ポケットを持つ任意の小分子および任意のタンパク質に適合させることができます。SmcRにドッキングするのに数分かかりますが、これは、この受容体の検索領域が以下に定義されているためです。新しい受容体の検索領域を定義する必要がある場合(ステップ2.15-2.20)、これは1回の3時間のラボ期間で完了できます。検索エリアが定義されると、その後のドッキングには数分かかります。 AutoDock ツールをダウンロードします。オペレーティングシステムに適したファイルを選択し、コンピューターにインストールします。注:このプロトコルは、AutoDockVinaのWebベースバージョンを利用しています。このプログラムがインストールされている場合は、ドッキングをローカルで実行することもできます(製造元の指示を参照してください)。 apo SmcRの構造をダウンロードします。 Protein Data Bankに移動します。 検索バーにPDB ID 3KZ9を入力します。 ページの右上隅にあるドロップダウンメニューから [ファイルのダウンロード ]をクリックし、[ pdb 形式]を選択します。 ファイルをダウンロードしたら、ドッキング作業専用の新しいフォルダ に保存します 。 低分子阻害剤(PTSP)の.mol構造ファイルを作成します。 molviewに移動し、ゴミ箱アイコンをクリックして、そこにある構造物を削除します。 ストラクチャーウィンドウにPTSPを描画します。 [2Dから3D]をクリックします。 「ツール」をクリックして→MOLファイルをエクスポート→。 「Molview.mol」というファイルがコンピュータにダウンロードされます。ファイルにわかりやすい名前を付け、タンパク質の pdb ファイルを含むフォルダ に保存します 。 検索領域を定義します。 Webinaの領域をタンパク質(SmcR)の結合ポケットとして定義し、正しい領域でのドッキングを容易にします。注:SmcRの座標は、次のプロトコルを使用して提供および生成されます。SmcR を使用している場合は、手順 2.15 から 2.20 をスキップできます。このプロトコールは、既知のリガンド結合ポケットを持つ任意のタンパク質に適合させることができます。座標: center_x = 17、center_y = 40、center_z = 56、size_x = 12、size_y = 12、size_z = 12。 AutoDockツールで、 File → Read Molecule をクリックし、ステップ2.5でダウンロードしたpdbタンパク質ファイルを開きます。 ダッシュボードに移動し、タンパク質の名前の横にある 青い矢印 をクリックします。これにより、チェーンのリストが表示されます。タンパク質鎖の1つの横にある 青い矢印 をクリックします。 結合ポケットのアミノ酸を強調表示するには、表示されたリストで目的のアミノ酸を見つけます。アミノ酸の隣にある、右端の Cl(色) 列の三角形に移動します。三角形をクリックして、 虹で選択します。注:この方法を使用して、次のアミノ酸を強調表示します:12 Phe75、Phe78、Leu79、Ile96、Met100、Trp114、Phe129、Asn133、Gln137、Val140、Ala163、Phe166、His167、Cys170(Met100が欠落している場合は、これをスキップできます)。 次に、[ Grid]→[GridBox]をクリックします。タンパク質構造の上に、赤、緑、青の面を持つボックスが表示されます。変更を加える前に、 Spacing (Angstrom) を 1 に変更します。これにより、次のステップのためにボックスが正しくスケーリングされます。次に、 中央グリッドボックス ダイヤルを変更して、ボックスをx、y、z方向に移動し、強調表示されたアミノ酸上に配置します。タンパク質をクリックしてドラッグすると、構造が3次元に回転します。注:これにより、ボックスが正しい位置にあることを確認できます。必要に応じて、ポイント数の上部3つのダイヤルを使用して、ボックスのサイズを変更します。 ボックスの位置と寸法を設定したら、[ファイル] → [ 閉じる] [現在の保存] をクリックします。 メニューで、「 グリッド」→「出力」→「GPFの保存」をクリックします。ファイルに名前を付けて、2 つのストラクチャー ファイルと同じフォルダーに保存します。このGPFファイルにはボックス座標があります。 Webinaで「ドッキング」を実行して、計算された結合エネルギーを生成します。 .mol リガンド ファイルと .pdb タンパク質ファイルを含むフォルダーを開きます。Webina は .pdbqt ファイルを必要とし、ファイル変換を行います。 Webina に移動します。 レセプター: pdb からダウンロードした 3kz9.pdb というファイルをドラッグします。 「水素原子の追加」をクリックし、「 変換」をクリックします。次のポップアップで [OK ]をクリックして、モノマーを操作します。 リガンド: PTSP(またはその他の低分子阻害剤)の.molファイルをドラッグします。ボックスが選択されていないことを確認し、[ 変換]をクリックします。「正しいポーズ」を空のままにして、ドッキングボックスまで下にスクロールします。適切なボックスパラメータ(上記のSmcR用またはステップ2.15-2.20のプロトコルで異なるタンパク質用に生成されたセット)を入力します。 「Webinaを起動」をクリックして待ちます。 一連の計算された結合エネルギーが、ドッキングされた分子の視覚化の直下に[アフィニティー(kcal/mol)]が報告されます。最初の値が最も負の値であることを確認します。 ドッキングされた配位子をpymolまたは他の同様のプログラムで視覚化するには、適切なダウンロードボタンをクリックして出力PDBQTファイルをダウンロードします。このファイルは、ドッキングされた座標の配位子(PTSP)にすぎません。 ドッキングされた配位子-SmcR複合体をPyMol13で可視化します。PyMolをダウンロードして開きます。注:フルタイムの学生と教育者は、PyMolライセンスを無料で受け取ることができます。PyMolを初めて起動した後にライセンスを求められたら、Buy Licenseをクリックします。 [学生/教師]を選択します。 3kz9.pdb という pdb ファイルを開きます。 Webina によって作成された pdbqt 出力ファイルを開きます。 最適なコンフォメーション(結合親和性が最も低いもの)を視覚化するには、PyMol画面の右下にある小さな 指差し矢印 をクリックします。最初のコンフォメーションが最も有利になり、ファイルを開いたときに表示されます。 標準コマンド14を使用して、PyMolにドッキングされたリガンドでタンパク質を操作します。注:Newmanらによる以前の研究では、Webinaによって決定されたいくつかの化合物の予測された結合親和性をin vitroおよびin vivoアッセイと比較しました9。これらの結合親和性は、結合ポケットの親和性が高い(kcal/mol数が低いことと相関する)良好な阻害剤である可能性が高い化合物の参照として機能します。Webinaの出力データの例を、SmcRのポケット内のPTSPバインディングの図3A,Bに示します。 3. クオラムセンシング阻害におけるチオフェネスルホンアミドの生物学的評価 注:ここでは、ビブリオ・カンベリイタンパク質LuxRのアッセイに特化した手順について説明します。しかし、この手順は、レポータープラスミドpJV0649と適合する異所性複製プラスミド上で利用可能なVibrio LuxR/HapRタンパク質のいずれかとの使用に適合させることができる。「red-green screen」アッセイは、2つのプラスミドを含む大腸菌細胞を使用して、異種細菌バックグラウンドで実施されます。LuxR/HapR発現プラスミド(カナマイシン耐性を付与する)は、異なるLuxR遺伝子を発現するものとして利用可能です(図4A)。pJV064プラスミド(クロラムフェニコール耐性を付与する)は、LuxR活性化プロモーターの制御下にあるgfp遺伝子と、LuxR抑制プロモーターの制御下にあるmCherry遺伝子をコードしています(図4A)。どちらのプロモーターも、in vivo15で発現に大きな変化をもたらすLuxR制御遺伝子として同定されたため、選択されました。LuxR/HapR 大腸菌株とプラスミドpJV064は以前に発表されています9,15。 液体培地の調製:1LのLB培地を調製します。NaCl 10 g、バクトトリプトン 10 g、酵母抽出物 5 g を秤量します。 ビーカーまたはメスシリンダー内の成分を攪拌板を使用して混合します。 メスシリンダーを使用して総容量を1Lにします。 必要に応じて、オートクレーブする前にボトルあたり100mLに分注します。 メディア1Lごとに15分間オートクレーブします。あるいは、オートクレーブが利用できない場合は、インスタントポットを使用することができます16。 株接種(1日目)最終濃度のカナマイシン(40 μg/mL)およびクロラムフェニコール(10 μg/mL)で、LB培地に抗生物質を添加します。 5 mLのLB / Kan40 / CM10培地をキャップ付きの滅菌試験管に分注します。 冷凍庫ストックからの大腸菌株への接種:LuxR/HapRおよびpJV064プラスミド(LuxR +)を発現する大腸菌培養9,15;大腸菌エンプティベクターコントロール培養とpJV064プラスミド(LuxR-)9,15. 培養物を275rpm、30°Cで一晩16〜18時間振とうします。 チオフェネスルホンアミドのアッセイ(2日目)化合物を~30mg秤量します。DMSOで100 mMに再懸濁し、ボルテックスして混合します。次に、10 mMのストックを準備します。 20 μL の 100 mM ストックと 180 μL の DMSO を混合して希釈 (1:10) すると、10 mM のワーキングストックが得られます。渦を混ぜます。 10 mLのLB/Kan/CM培地中のLuxR+培養物とLuxR-培養物(1:100)を15 mLのコニカルチューブにバック希釈し、ボルテックスで短時間ボルテックスして混合します。 アッセイには、ブラックウェル、透明底、滅菌96ウェルプレートを使用してください。 すべてのカラムに対して希釈系列を調製します。参考として、4倍希釈シリーズの図が含まれています(図4B)。注:このプロセスには、デジタルマルチチャンネルピペットをお勧めします。この方法は、4倍希釈シリーズ(1:4)用です。ただし、異なる希釈シリーズ(1:10、1:5など)を使用してもよい。LuxR+培養液200μLをA列1-6列の96ウェルプレートにピペットで移します(図4B、緑)。 LuxR-培養液200μLをA列7-12の96ウェルプレートにピペットで移します(図4B、オレンジ色)。 LuxR+培養液150μLをB-E列、1-6列目の96ウェルプレートにピペットで移します(図4B、緑)。 150 μLのLuxR-培養液をピペットで、列B-E、7-12の96ウェルプレートにピペットで入れます(図4B、オレンジ色)。 図4Bに従って、2 μLの化合物またはDMSOを列Aの各ウェルに加えます。 各列について、ピペを3回上下させた後、同じ列で行Aから行Bに50μLを移します。 列B、C、D、Eについて、ミキシングとピペッティングを繰り返します。E列を混合した後、50μLを取り出して廃棄物に入れます。最終的には、各ウェルに150μLが含まれている必要があります。 プレートを微多孔質テープで覆います。 プレートを275rpm、30°Cで一晩16〜18時間振とうしてインキュベートします。 アッセイプレートの蛍光と光学密度を測定します(3日目)。テープはじき出し、ウェルから液体をこぼさないようにしてください。 プレートリーダーで、600 nm(OD600)、GFP、およびmCherryの光学密度を読み取ります。注:アッセイ間の比較を可能にするために、両方の蛍光チャネルに設定されたゲインが推奨されます。 細胞あたりの正規化蛍光としてデータを記録します:GFP/OD600 およびmCherry/OD600。 図5に示すようにデータをプロットし、DMSO制御の結果とテストサンプルの比較を示します。 4. 黒色のアッセイプレートを洗浄して再利用する プレートを漂白剤に浸します。1Lのプラスチックビーカーには「生物学的廃棄物」とラベルを付けます。プレートからこの廃棄物容器に液体を捨てます(70%EtOHで滴りを慎重に清掃します)。噴出ボトルからのDI水でプレートを廃棄物の上にすすぎ、その中に捨てます。 別の1Lプラスチックビーカーに「30%漂白剤」とラベルを付けます。この容器に皿/蓋を入れ、30%漂白剤で覆います。上部をプラスチックシートで包み、チップボックスなどでプレートの重量を量ります。漂白剤溶液に一晩浸します。 エタノールですすぎ、浸します。プレートをDI水でシンクに十分にすすぎ、漂白剤が残らないようにします。井戸から残っている水はシンクに捨てます。 スプレーボトルを使用して、すべてのウェルと蓋に70%のEtOHを添加します。プレートを直立させ、蓋を上にして斜めにし、EtOHが蒸発できるようにし、ウェルに何も落ちないようにします。プレートを一晩置いておきます。 プレートを乾かします。残っているEtOHを捨てます。 プレートをペーパータオルの上にひっくり返し、残りのEtOHを蒸発させます。プレートをこのままドラフトに入れておきます。プレートは次の使用の準備ができています。

Representative Results

代表的な結果として、学部生が化合物1A、2B、および3Bについて合成した3つのチオフェネスルホンアミド化合物のデータが含まれています(図5A-C;詳細はNewmanらに記載されています。各化合物は、V. campbellii LuxRを発現する大腸菌株で、pJV064レポータープラスミドを使用して試験しまし?…

Discussion

このCUREはもともと、2段階、3週間の短縮プロトコル(設計/合成およびアッセイ)として開発され、上位レベルの有機実験室コース8の一部として5学期に実施されました。最初のレポートから、コンピューターモデリングモジュールが追加され、 大腸菌 アッセイは初心者の研究者向けに最適化されました。その結果、インディアナ大学のArts and Sc…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本書で報告された研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の国立総合医科学研究所(National Institute of General Medical Sciences)の支援を受け、JVKに授与された第R35GM124698号です。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

2-thiophensulfonyl chloride Ambeed A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole Ambeed A104401 98%
96-well clear bottom black plates USA Scientific 5665-5090Q 96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case 
Autodock Tools http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina https://vina.scripps.edu 
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate Fisher Scientific AA31344M4 Reagent grade
hexanes Fisher Scientific H291
Kanamycin
magnesium sulfate Fisher Scientific M65-500 Anhydrous
Microporous Film USA Scientific 2920-1010 Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview molview.org
NaCl
Protein Databank https://www.rcsb.org/
Pymol https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper Fisher Scientific 09-805-342 Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel Sorbtech 30930M-25 Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride Millipore Sigma 452912 60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran Fisher Scientific MTX02847 Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates Sorbtech 1634067 Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract

参考文献

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記事を引用
Brown, L. C., Chopra, J., Horness, R. E., van Kessel, J. C. Synthesis and Assay of Vibrio Quorum Sensing Inhibitors. J. Vis. Exp. (207), e66582, doi:10.3791/66582 (2024).

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