タンパク質上の糖鎖を自動的かつ迅速に分析するためのシステムは、以前に開発されました。本稿では、バイオ医薬品やその他の複合糖質材料の糖鎖構造解析に従事するユーザーなど、幅広いユーザー向けに最適化された「糖質定性分析」のプロトコールを紹介します。
タンパク質のグリコシル化は、重要な翻訳後修飾であり、バイオ医薬品を含む組換えタンパク質の安定性、有効性、免疫原性に影響を与えます。糖鎖構造は、生産細胞の種類、培養条件、精製方法によって異なる大きな不均一性を示します。そのため、組換えタンパク質の糖鎖構造のモニタリングと評価は、特にバイオ医薬品の製造において非常に重要です。レクチンマイクロアレイは、質量分析を補完する技術であり、高い感度と使いやすさを誇っています。ただし、通常、結果を出すには1日以上かかります。非糖質科学研究や医薬品プロセス開発に適応させるためには、自動化されたハイスループットな代替手段が必要です。そこで、世界初の全自動レクチンベースの糖鎖プロファイリングシステムが、「BEST (bead array in a single tip)」技術のコンセプトを活用して開発されました。このシステムにより、レクチン固定化ビーズを1,000個単位で調製・保存することができ、様々な目的に合わせてカスタマイズ可能な並列挿入順序が可能です。この記事では、「glyco-qualified」組換えタンパク質を含む研究の実用的なプロトコルを紹介します。12種類のポリアクリルアミド-糖鎖複合体に対する反応性を検証した後、システムの汎用性を高めるために15種類のレクチンを選択しました。さらに、Cy3からビオチンに切り替えることでサンプルのラベリングプロセスが最適化され、全体の処理時間が30分短縮されました。即時のデータ適格性評価のために、レクチン結合シグナルはトップモニターにドットコードとして表示されます。このシステムの信頼性は、日々の再現性試験、再現性試験、長期保存試験を通じて確認され、変動係数は<10%でした。このユーザーフレンドリーで迅速な糖分析装置は、バイオマーカーの評価と検証のための内因性糖タンパク質の品質モニタリングに応用できる可能性があります。この方法は、糖質科学に不慣れな人でも解析を容易にし、その実用的な有用性を広げます。
タンパク質のグリコシル化は、バイオ医薬品で評価する必要がある重要な翻訳後修飾です。タンパク質の糖鎖プロファイルは、培養条件、精製プロセス、宿主細胞によって異なります1。バイオプロセスパイプライン内でグリコシル化を適格性評価するには、簡単な装置が必要です。 in vivo で分泌されるタンパク質および膜タンパク質の50%以上が複数の糖鎖で修飾されていると推定されており、糖鎖は細胞系譜、発生段階、悪性腫瘍の発症などの疾患状態によって変化します2。糖鎖プロファイルのモニタリングは、独自の診断マーカーや薬物標的を同定するための大きな可能性を秘めています。大規模なサンプルサイズを迅速に測定できる自動装置は、創薬パイプラインの数百の患者サンプルからのこのような異常なグリコシル化を検証および検証するために高い需要があります。
マイクロアレイ技術は、糖タンパク質の糖鎖プロファイリングを評価するためにグライコミクスに組み込まれています3。この方法では、スライドガラスなどの表面に糖鎖結合タンパク質であるレクチンを数個固定化します。この相互作用に基づく糖鎖分析技術は、コアタンパク質から糖鎖を事前に放出する必要がないため、糖鎖技術に不慣れな研究者のプロセスを簡素化します。バイオプロダクションなどの産業用途では、広く利用されているにもかかわらず、より多くの分析ターゲットについて糖鎖を迅速かつ容易にモニタリングできる自動化システムが必要でした。これに対処するために、当初ジェノタイピング用に開発された「Bead Array in a Single Tip」(BIST)と呼ばれる独自の概念に基づく自動糖鎖プロファイリングシステムが以前に報告されました。このシステムは、ワンボックスタイプのハイスループットオートインストゥルメント4でプロセスを簡素化します。4,5、様々なレクチン固定ビーズを並列に並べたヒントを用いて、糖タンパク質に修飾された糖鎖構造を解析する手法を確立し、GlycoBYST(以下、自動糖鎖プロファイリングシステム)と名付けた(図1A)。レクチンは1,000個のビーズに固定し、チップに詰める前と後の両方で1年間活性を維持するために乾燥させることができます。HRP標識抗ストレプトアビジン抗体(SA-HRP)などの試薬をセットしたチップとカートリッジを試作測定装置(自動反応測定装置、材料表参照)にセットすると、チップはオートピペットとして機能します。装置内部背面の化学発光検出スキャナーは、8つのチップの信号を同時に定量化します。これら8つのチップからの定量データは、測定結果を迅速に確認するために、機器のタッチスクリーンにコンパクトかつ同時にドットコードとして表示されます。さらに、測定されたピークの最大値として表された値は、生データとして装置から転送され、個々の研究者によるグラフ化が可能になります(図1A、下段)。
この記事では、著者らは、ビオチン標識タンパク質の改良された方法について説明し、処理時間を30分に短縮します。標的タンパク質は事前にビオチン化され、SA-HRPによって検出されます(図1B)。15種類のレクチンを選択した標準的なGlycoBISTチップ(自動糖鎖プロファイリング専用チップ)を作製し、解析の網羅性を高める汎用性の高い糖タンパク質糖鎖プロファイリングを実現しました。
本研究では、「Bead Array in a Single Tip」技術を用いた糖鎖修飾の迅速評価技術を開発しました。本研究では、糖質科学の研究者と非糖質科学の研究者の両方を対象に、日常的で包括的な糖鎖修飾評価を容易にするために設計された標準的なGlycoBISTチップを導入しました。レクチンマイクロアレイは、典型的には20-100個のレクチン12,13を用いており、評価に広く利用されている。しかし、マイクロアレイ上の一部のレクチンの特異性が重複していることや、粗い臨床サンプルのグライコミクスと比較して、標的糖タンパク質上のグリコフォームの種類が比較的限られていることを考慮すると、焦点を絞った糖鎖プロファイリングの簡易評価には15個のレクチンで十分であると予想されました。
このプロトコールの重要なステップは、レクチンを固定化したビーズまたはそれらのビーズで満たされたチップを、保存後に室温に戻してから測定に使用することです。特に、結露は信号を弱めることが観察されました。したがって、保存袋は室温に戻るまで絶対に開けないことをお勧めします。ビオチン化試薬の保管には、保存前に完全に乾燥させることも不可欠です。乾燥プロセスが不十分な場合、ビオチン化試薬14の加水分解により、タンパク質に対するビオチン化の効率が低下する。
修正とトラブルシューティングに関しては、特に自動反応測定装置の測定方法に関するばらつきを減らすための方法が検討されました。特に、分析に用いるリザーバー内のバッファー容量が150μLの場合、チップ内に気泡が入り込むため、反応効率が低下し、値のばらつきが大きくなります。したがって、少なくとも200μLのバッファーをリザーバーに入れることをお勧めします。
オートピペッティング中にチップに充填される液体の量も重要な要素です。先端は、液体が次の反応ステップに移動するときに液体を完全に排出することはできません。したがって、少なからず、前のステップのバッファーは次のステップに持ち越され、新しいバッファーが吸引されるときに、前のバッファーは挿入された溶液の上部領域に残ります。したがって、基質およびその他の溶液は、上部リザーバーを満たすために十分に吸引する必要があります( 図1Aを参照)。装置上での抗体反応は不可逆的であることを考えると、初期設定中のエラーを避け、注意を払うことが重要です。
この方法の1つの制限は、血清および培養上清に由来する可溶性タンパク質に限定されることです。現在の方法では、レクチンはビーズに共有結合していないため、細胞抽出物や組織抽出物などの高濃度の界面活性剤を含むサンプルを分析することができません。したがって、これらの制限に対処するには、将来の改善が必要です。
レクチンビーズアレイの重要性は、ビーズに固定されたレクチン種の互換性と拡張性にあります。例えば、全自動糖鎖プロファイリングシステムを用いた大規模差解析(>1,000サンプル)では、レクチンマイクロアレイを用いた標的糖タンパク質の糖鎖プロファイリング(<100サンプル)を事前に行い、チップ内の15レクチンのラインナップを調整することができます。さらに、レクチン固定ビーズの安定性が高いため、初期のチップ設計から日常的な手順による測定まで、すぐに実験を行うことができます。高い信頼性を示した28種類のレクチンのうち25種類(表1)だけでなく、ユーザーが関心のある任意のレクチンを使用して、前述の定期的な信頼性試験に従って、特定の実験のためのカスタム自動糖鎖プロファイリングシステムを作成することができます。このアプローチにより、標準的な糖鎖プロファイリングシステムと組み合わせて、8種類の異なるチップからなる120-lectinビーズアレイの設計が可能になりました。
これまでの研究では、レクチンマイクロアレイ15に沿ったCy3標識糖タンパク質の検出手順の確立に焦点が当てられていました。この方法は、蛍光干渉のため、チップ内で並列に13個のレクチンに制限されていました。HRP検出標識を使用する現在の方法では、15個のレクチン固定ビーズと2個のコントロールビーズ(ポジティブおよびネガティブ)をチップに収納できます。さらに、サンプルのビオチン化により、分析プロセスが短縮されました。
この分析手法は、学術研究だけでなく、医学・薬学研究、食品、化粧品などの産業分野にも応用できます。レクチンマイクロアレイおよびグライコプロテオミクス技術は十分に確立されていますが、この研究のアプローチは、その完全な自動化とより少ないステップでの迅速な分析能力において依然として重要です。今後は、特定の糖タンパク質を用いてシグナルを正常化し、チップにレクチン固定ビーズと抗体固定ビーズを併用することで、この解析を定量的な方法に強化していく予定です。
The authors have nothing to disclose.
本研究は、国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)の助成を受け、課題番号JPMJTR204A、一部は日本学術振興会科学研究費23H02680(AK)の支援を受けて行われました。英語の編集にご協力いただいたエディテージ(www.editage.jp)に感謝いたします。
0.2 mL 8 PCR tubes + flat cap | FastGene | FG-0028FC/SE | For dispensing and storage of biotin labeling reagents |
2.0 mL SC Micro Tube protein LB | SARSTEDT AG&Co. KG | 72.694.600 | For loading samples in LuBEA-VIII |
Analysis software | SAS Institute Inc. | JMP 17 | |
Anti-Static Ionizer. 110 volts | Plas-Labs | 800-AS/SPI | Use while inserting beads into BIST Tip. |
Antistatic tweezers NK2A | RUBIS | 9-5681-01 | Use while inserting beads into BIST Tip. |
Automated reaction measurement device | Precision System Science Co., Ltd. | LuBEA | All data in this study were obtained using LuBEA-VIII. While LuBEA is commercialized, LuBEA-VIII is currently in the development phase. The website for product details of LuBEA and LuBEA-VIII can be found at the following URL (https://www.pss.co.jp/english/technology/apit/bist02.html). |
Biotin-(AC5)2 Sulfo-Osu | Dojindo | 341-06801 | As biotinilation reagent |
BIST spacer bead- V-11 | Precision System Science Co., Ltd. | F4938000 | Diameter: 1 mm |
BIST tip and sheath | Precision System Science Co., Ltd. | F4930-000 | Fill this empty tip with beads. |
Calcium chloride | Wako | 039-00475 | For preparing buffer solutions |
Can Get Signal Solution 2 | TOYOBO | NKB-301 | This blocking reagent is good for this method |
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrators | Labconco | 7810010 | For dry of biotinilation reagent. The substitution provided by other companies is possible. |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705060 | For measuring the samples by LuVEA VIII |
Cold trap CentriVap series | Labconco | 7460040 | For dry of biotinilation reagent. The substitution provided by other companies is possible. |
Glycine | Wako | 077-00735 | For preparing buffer solutions |
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate | Wako | 139-00722 | For preparing buffer solutions |
Milli-Q reference | MERCK | ZIQ7000T0C | As deionazed water for dilution of reagents and buffers |
PBS | Wako | 162-19321 | For preparing buffer solutions |
Peroxidase Streptavidin | Jackson | 016-030-084 | This antibody is good for GlycoBIST analysis. It is useful for the detection of the western blotting, although substitutions can be provided by other companies. |
Probe bead | Precision System Science Co., Ltd. | FP4936000 | For preparing lectin-fixed beads. See Shimazaki, H. et al., Current Protocols in Protein Science, 2020 in reference section for detail. |
Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030108442 | Use while preparing the samples such as biotinylation. |
Silica gel (for desiccan) | Kanto chemical | 37039-02 | Use while storing the GlycoBIST tip and dried biotinylation reagent. |
Static electricity removal sheet M | TRUSCO NAKAYAMA | SD5050 | Use while inserting beads into BIST Tip. |
SV Cartridge II | Daido Chemical Industry | ED041 | For measuring the samples by LuVEA VIII |
Table Microcentrifuge-CAPSULEFUGE | TOMY | PMC-060 | For spin-down of the mixture in each process |
Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | For preparing buffer solutions |