概要

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

Published: February 23, 2024
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概要

ここでは、光学的光熱赤外蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)、別名中赤外光熱魚(MIP-FISH)を使用して、個々の細胞を特定し、その代謝を理解するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、単一細胞分解能による細胞代謝のマッピングなど、さまざまなアプリケーションに幅広く適用できます。

Abstract

複雑なコミュニティ内の個々の細胞の代謝活性を理解することは、ヒトの疾患におけるそれらの役割を解明するために重要です。ここでは、rRNAタグ付きFISHプローブと同位体標識基質を組み合わせることにより、OPTIR-FISHプラットフォームを使用した細胞同定と代謝解析を同時に行うための包括的なプロトコールを紹介します。蛍光イメージングは、rRNAタグ付きFISHプローブの特異的結合による細胞同定を提供し、OPTIRイメージングは、OPTIRスペクトル上の同位体誘導赤方偏移による単一細胞内の代謝活性を提供します。 13C-グルコースで培養した細菌をテストベッドとして使用して、プロトコールでは、同位体標識、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)、サンプル調製、OPTIR-FISHイメージングセットアップの最適化、およびデータ取得による微生物培養の概要を説明します。また、画像解析を実行し、シングルセルレベルでスペクトルデータを高スループットで解釈する方法も示します。このプロトコルの標準化された詳細な性質は、広範な単一細胞代謝研究コミュニティ内の多様な背景や分野の研究者による採用を大幅に促進します。

Introduction

細胞代謝は、細胞生物学の基本的な柱であり、細胞の健康、機能、および環境との相互作用を決定する多くのプロセスを導いています。個々の細胞レベル、特に天然環境における代謝の解析は、生体システムにおける不均一で複雑な活動を明らかにするための貴重な洞察を提供します1。これは、多くの微生物が従来の栽培方法に挑戦する独自の成長要件または環境依存性を示すため、微生物の研究において特に重要です2。例えば、ある種は、実験室の設定では容易に再現できない特定の栄養組成や共生関係を必要とする場合があり、したがって、標準的な技術では培養不可能になる3。さらに、特定の種の培養に必要な長期化は、微生物学研究にとって大きな課題となり、多くの場合、研究と分析の実際の時間枠を超えて延長されます。これらの制限を回避するために、ポリメラーゼ連鎖反応や蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)などの代替法により、培養を必要とせずに微生物種を同定することができ4、これにより、微生物生態系のより正確で全体的なビューを達成することができます。しかし、これらの解析技術では細胞代謝を解明する能力が不足しています。このギャップは、微生物学分野で進行中の課題、つまり細胞の同一性を分化し、単一細胞レベルでの代謝を解明するという並行課題を浮き彫りにしています。安定同位体と組み合わせたイメージング質量分析(IMS)などの技術の進歩は、シングルセル代謝分析の強力なツールとして浮上しています5。これらの実験では、 細胞を13Cまたは 15Nなどの同位体を含む基質とインキュベートしました。新たにアナボライズされた生体分子はこれらの同位体を運び、m/zスペクトル上で区別することができます。しかし、IMSは、高価な装置、複雑なサンプル調製、比較的低いスループット、およびm/zスペクトルの分析に必要な専門知識に悩まされています。分子マーカー特異的蛍光イメージングと組み合わせることで、特異性を高めた細胞代謝の解明が進歩しています6。それにもかかわらず、これら2つのモダリティを橋渡しする課題は依然として残っています。IMSと蛍光イメージングの分解能の違いは、異なる操作設定と相まって、所見の整合と相関を困難にしています7

振動分光イメージングと安定同位体標識の統合は、シングルセル代謝の研究に新たなソリューションを提供します。より重い同位体を取り込むと、化学結合の振動が遅くなり、振動スペクトル8に赤方偏移のピークが生じます。特に、振動イメージングは蛍光イメージングに匹敵する空間分解能を提供し、代謝定量と細胞同定の両方を1回のセットアップで実行できるため、画像のレジストレーションと相関が簡素化されます。私たちの最近の研究では、高度な振動イメージングプラットフォームである光学光熱赤外(OPTIR)と蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)の組み合わせを実証し、細菌群集のグルコース代謝をプローブしています9 (図1)。OPTIRは、可視光の変化を検出することにより中赤外吸収の光熱効果を利用した振動分光顕微鏡システムであり、光学顕微鏡と同様にサブマイクロメートルの分解能を提供しますが、中赤外吸収に由来する追加の振動分光情報を提供します。FISHは、単一細胞レベルで微生物の同一性を決定するために一般的に使用される手法です。オリゴヌクレオチドの配列は、異なる分類群の特定の16S配列を標的とするように設計でき、異なる蛍光色素を結合させることができます。設計されたオリゴヌクレオチドプローブと標的rRNAとの特異的なハイブリダイゼーションは、個々の細胞内の標的分子種の強力な蛍光シグナルをもたらし、マルチチャネル蛍光イメージングを実行して集団内の複数の分子種を同定することができます。OPTIRと蛍光イメージングはどちらも光学検出に基づいているため、OPTIRとFISH蛍光の組み合わせは簡単に実装できます。この 2 つのモダリティは、シングルセル解析用の光学分解能を共有しており、追加のアライメントや共レジストレーションを必要とせずに便利に切り替えることができます。

このプロトコールは、OPTIR-FISHプラットフォームを活用して高度なシングルセル構造機能解析を行うための詳細なガイドを提供します。13C-グルコース含有培地で増殖した細菌サンプルを試験床として使用し、13C-グルコースからのde novoタンパク質合成を定量しました。このプラットフォームの細胞同定能力を実証するために、rRNAを標的としたFISHプローブを用いて各種を標識した細菌混合物を使用しました。このアプローチにより、大腸菌(E. coli)やバクテロイデス・シータイオタミクロン(B. theta)などの特定の細菌株の正確なシングルセル同定と、それらの代謝が容易になりました。このプロトコルは、研究者に単一細胞レベルでの代謝プロファイリングと種の同定を同時に行うための強力なツールを提供し、細胞の相互作用、生理学、および複雑な環境におけるそれらの役割についての理解を深めることを約束します。

Protocol

この研究での細菌標本の使用は、ボストン大学の治験審査委員会(IRB)および国立衛生研究所のガイドラインに従っています。 注:このプロトコルで従う一般的なワークフローを 図2にまとめます。 1. 細菌培養と同位体標識(図2A) 注:ここに…

Representative Results

OPTIR-FISHによる遺伝子同定によるシングルセル微生物代謝解析の一般的なワークフローは、以下にまとめられています。 図 2.OPTIRのシングルセル代謝イメージング能力を示す代表的な結果は、以下の通りです。 図 3.この例では、大腸菌細胞をインキュベートしました。 12C- または 13C-グルコースを24時間。?…

Discussion

ここでは、OPTIR-FISHプラットフォームを適用して、微生物種の同定と代謝活性の定量をシングルセル分解能で同時に行うための詳細なプロトコールについて説明しました。重要なステップには、特定の代謝活性を研究するための安定同位体標識による培養と、標的微生物種を特定するための蛍光 in situ ハイブリダイゼーションが含まれます。選択した波数での?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、J.X.C.R01AI141439国立衛生研究所R35GM136223の支援を受けました。

Materials

96% Ethanol ThermoScientific T032021000
Calcium Fluoride Crystran CAFP10-0.35
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021-1KG
D-Gluocose (U-13C6, 99%) Cambridge Isotopic Laboratories CLM-1396-1
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
formamide ThermoScientific 17899
Luria-Bertani broth  Sigma-Aldrich L3522-250G
M9 Minimal Salts 5x SIGMA M6030-1KG
OPTIR instrument Photothermal Spectroscopy Corp. mIRage LS
Paraforaldehyde Solution, 4% in PBS ThermoScientific J19943-K2
poly-L-lysine solution 0.1% (w/v)  Sigma-Aldrich P8920-500ML
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-25G
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771-25G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 99+% ThermoScientific A11379.18
Trypic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G

参考文献

  1. Evers, T. M. J., et al. Deciphering metabolic heterogeneity by single-cell analysis. Anal Chem. 91 (21), 13314-13323 (2019).
  2. Overmann, J., Abt, B., Sikorski, J. Present and future of culturing bacteria. Annu Rev Microbiol. 71, 711-730 (2017).
  3. Epstein, S. The phenomenon of microbial uncultivability. Curr Opin Microbiol. 16 (5), 636-642 (2013).
  4. Su, C., Lei, L., Duan, Y., Zhang, K. -. Q., Yang, J. Culture-independent methods for studying environmental microorganisms: methods, application, and perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 93 (3), 993-1003 (2012).
  5. Musat, N., Foster, R., Vagner, T., Adam, B., Kuypers, M. M. Detecting metabolic activities in single cells, with emphasis on nanoSIMS. FEMS Microbiol Rev. 36 (2), 486-511 (2012).
  6. Jiang, H., Kilburn, M. R., Decelle, J., Musat, N. NanoSIMS chemical imaging combined with correlative microscopy for biological sample analysis. Curr Opin Biotechnol. 41, 130-135 (2016).
  7. Porta Siegel, T., et al. Mass spectrometry imaging and integration with other imaging modalities for greater molecular understanding of biological tissues. Mol Imaging Biol. 20 (6), 888-901 (2018).
  8. Lagunov, O., Drenchev, N., Chakarova, K., Panayotov, D., Hadjiivanov, K. Isotopic labelling in vibrational spectroscopy: a technique to decipher the structure of surface species. Top Catal. 60, 1486-1495 (2017).
  9. Bai, Y., Guo, Z., Pereira, F. C., Wagner, M., Cheng, J. -. X. Mid-infrared photothermal-fluorescence in situ hybridization for functional analysis and genetic identification of single cells. Anal Chem. 95 (4), 2398-2405 (2023).
  10. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Wagner, M., Schleifer, K. -. H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of proteobacteria: problems and solutions. System Appl Microbiol. 15 (4), 593-600 (1992).
  11. Manz, W., Amann, R., Ludwig, W., Vancanneyt, M., Schleifer, K. -. H. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment. 微生物学. 142, 1097-1106 (1996).
  12. Daims, H., Stoecker, K., Wagner, M. Fluorescence In Situ Hybridization for the Detection of Prokaryotes. Molecular Microbial Ecology. , (2004).
  13. Bridger, J. M., Volpi, E. V. . Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications. , (2010).
  14. Wang, D. O., et al. A quick and simple FISH protocol with hybridization-sensitive fluorescent linear oligodeoxynucleotide probes. RNA. 18 (1), 166-175 (2012).
  15. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Res. 44, D586-D589 (2016).
  16. Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. mathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. 77 (3), 1118-1122 (2011).
  17. Lima, C., Muhamadali, H., Xu, Y., Kansiz, M., Goodacre, R. Imaging isotopically labeled bacteria at the single-cell level using high-resolution optical infrared photothermal spectroscopy. Anal Chem. 93 (6), 3082-3088 (2021).
  18. Yin, J., et al. Nanosecond-resolution photothermal dynamic imaging via MHZ digitization and match filtering. Nat Commun. 12 (1), 7097 (2021).
  19. Bai, Y., Yin, J., Cheng, J. -. X. Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect. Sci Adv. 7 (20), (2021).
  20. Xia, Q., Yin, J., Guo, Z., Cheng, J. -. X. Mid-infrared photothermal microscopy: principle, instrumentation, and applications. J Phys Chemi B. 126 (43), 8597-8613 (2022).
  21. Du, J., Wang, H., Wei, L. Bringing vibrational imaging to chemical biology with molecular probes. ACS Chem Biol. 17 (7), 1621-1637 (2022).
  22. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Phys Biol. 16 (4), 041003 (2019).
  23. Shi, L., et al. Mid-infrared metabolic imaging with vibrational probes. Nat Methods. 17 (8), 844-851 (2020).
  24. Bai, Y., et al. Single-cell mapping of lipid metabolites using an infrared probe in human-derived model systems. Nat Commun. 15 (1), 350 (2024).
  25. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng. 3 (5), 402-413 (2019).
  26. Ge, X., et al. SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (26), e2203519119 (2022).
  27. Bai, Y., et al. Ultrafast chemical imaging by widefield photothermal sensing of infrared absorption. Sci Adv. 5 (7), 7127 (2019).
  28. Zhang, J., Zhao, J., Lin, H., Tan, Y., Cheng, J. -. X. High-speed chemical imaging by dense-net learning of femtosecond stimulated Raman scattering. J Phys Chem Lett. 11 (20), 8573-8578 (2020).
  29. Lin, H., et al. Microsecond fingerprint stimulated Raman spectroscopic imaging by ultrafast tuning and spatial-spectral learning. Nat Commun. 12 (1), 3052 (2021).
  30. Fu, P., et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat Photon. 17, 330-337 (2023).
  31. Tamamitsu, M., et al. Mid-infrared widefield nanoscopy. arXiv. , (2023).

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記事を引用
Guo, Z., Bai, Y., Pereira, F. C., Cheng, J. Optical Photothermal Infrared-Fluorescence In Situ Hybridization (OPTIR-FISH). J. Vis. Exp. (204), e66562, doi:10.3791/66562 (2024).

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