概要

マウス手術モデルにおける拡張78%肝切除術

Published: May 24, 2024
doi:

概要

部分的な2/3(66%)肝切除術のマウスモデルは文献でよく説明されていますが、肝移植後のスモールフォーサイズ症候群を模倣したより広範な肝切除術はほとんど使用されていません。マウスモデルにおける拡張78%肝切除術手順について説明し、健康なマウスで術後致死率が約50%になります。

Abstract

マウスの部分的な2/3肝切除術は、肝臓の再生能力を研究し、多くの疾患モデルにおける肝臓切除の結果を調査するための研究で使用されています。マウスの古典的な部分的な 2/3 肝切除術では、5 つの肝葉のうち 2 つ、つまり肝臓質量の約 66% を占める左葉と正中葉が 一括 で切除され、術後生存率は 100% と予想されます。より積極的な部分肝切除術は技術的により困難であるため、マウスではほとんど使用されていません。当グループでは、左上葉、正中葉、右上葉を含む5つの肝葉のうち3つを別々に切除し、肝臓全体の約78%を切除する拡張肝切除術のマウスモデルを開発しました。この拡張切除は、他の点では健康なマウスでは、常に適切でタイムリーな再生を維持できるとは限らない残存肝臓を残します。再生に失敗すると、劇症肝不全により、最終的に術後 1 週間以内に 50% の致死率が得られます。マウスにおける拡張78%肝切除術のこの手順は、スモール・フォー・サイズ症候群の研究と、肝臓移植または癌の拡張肝切除の設定における肝臓再生と転帰を改善するための治療戦略の評価のためのユニークな手術モデルを表しています。

Introduction

1931年に初めて報告されたマウスおよびラットの外科的肝臓切除モデルは、肝臓再生の分子基盤を研究するために利用される最も一般的な実験モデルです。また、トランスレーショナルサイエンス研究において、長期にわたる肝切除術や最適でない肝移植片の移植後の転帰を改善するための戦略を試験し、開発するための有用性も期待できます1,2,3,4。マウスの部分肝切除術 (PH) では、総肝臓量 (TLM) の約 2/3 (66%) の除去が必要ですが、健康な動物で実施すると、優れた結果が得られます5。この手順は期間が短く、マウスの肝臓の解剖学的構造にほとんどばらつきがないため、簡単に再現でき、術後の生存率は通常100%に近くなります1。

左葉(LL)と正中葉(ML)の切除を含む部分的な2/3肝切除術は、葉の炎症や肝臓の流入と流出の制限によって比較的妨げられることなく、残存葉を再生することを可能にします。むしろ、PH後の肝臓の正弦波内皮細胞の門脈の流れとそれに続くせん断ストレスの増加は、内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)の発現の持続的なアップレギュレーションとそれに続く一酸化窒素(NO)の放出をもたらし、これは増殖と肝臓再生のための肝細胞のプライミングに貢献します3。非アルコール性脂肪性肝疾患などの疾患モデルや特定の遺伝的背景で 2/3 PH 後に一般的に研究される結果には、急性肝不全のリスク、肝臓再生能力の定性的および定量的測定、およびストレスや外傷に対するその他の生物学的反応が含まれます 1,3

しかし、機能的または解剖学的に小さなサイズの症候群を模倣したマウスモデルは、癌に対する長期の肝臓切除、または辺縁(脂肪症または長期の虚血時間)または部分的(分割または生体ドナーの肝臓からの)移植後に発生するため、まだ十分に確立されていません。このニーズに対処するには、最小の(および機能的な)肝臓腫瘤の維持を超えて拡張するより広範な肝臓切除のモデルが必要であり、これは、サイズに対して小さい肝臓症候群と、この症候群に関連する死亡率の上昇をモデル化する必要があります6,7

マウスの肝臓の解剖学的構造は、最小限のばらつきを示します。マウスの肝臓は5つの葉から構成され、それぞれが肝臓の総質量に占める割合は、左葉(LL;34.4 ± 1.9%)、中央葉(ML;26.2 ± 1.9%)、右上葉(右上葉とも呼ばれる)葉(RUL;16.6 ± 1.4%)、右下葉(右下葉とも呼ばれる)14.7 ± 1.4±%)です5.各葉は、肝動脈の枝、門脈の枝、および胆管5を含む門脈トライアドによって供給される。歴史的に、LLとMLを切除することにより2/3 PHを実行するいくつかの手法が説明されていました。これらには、1)切除された各葉の基部に単一の結紮糸を一括して配置する古典的な技術が含まれます。2)切除された葉の基部に適用されるチタンクリップを使用する止血クリップ技術。3)クランプの近位にピアス縫合糸を使用する血管指向の実質保存技術。4) 門脈と肝動脈の枝が葉切除術1 の前に結紮される血管指向の顕微手術技術。各手法には相対的な長所と短所がありますが、致死率が高いものはありません1,8,9

この研究では、マウスで78%PHを延長するための新しい方法を紹介します。このモデルでは、LL、ML、RULを含む5つの肝葉のうち3つが、結紮糸法を使用して別々に除去されます(図1)。この手順により、全肝臓量の約78%(77.2±5.2%)が切除されます。LLとMLを別々に除去するという私たちの選択は、古典的なPH技術のように「一括」ではなく、これら2つの葉の一括切除に関連する合併症を最小限に抑えます。たとえば、肝上大静脈狭窄や、単一の結紮糸が大静脈1に近すぎると残りの葉の壊死のリスクが高まります1011121314。これは、RULを削除する手順の最終ステップに進む前に重要です。8-12週齢の野生型C57BL/6マウスにおけるこの広範な肝切除術は、肝臓再生の失敗により、手術後1週間以内に50%の致死率を引き起こし、劇症肝不全を引き起こします15,16。このマウスモデルは、78%の肝切除術を延長した後の致死率の上昇を示しており、スモール・フォー・サイズ症候群の病態生理を適切に再現し、転帰を改善するための新しい戦略の開発と試験を可能にします。

Protocol

この手順プロトコルに記載されている方法は、ベスイスラエルディーコネスメディカルセンター(BIDMC)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。すべての実験は、IACUCおよびBIDMC動物研究施設ガイドラインに準拠して完了しました。 1. マウス術前準備 マウスの腹部を胸骨中央部から恥骨上部までバリカンで剃ります。 100%酸素中の1〜4%イソフルランで全身麻酔を誘発します。麻酔をかけたら、マウスを仰臥位にして手術野に置き、その下に加熱パッドを付けます。切開を行う前に、つま先をしっかりとつまんで、ペダル反射がないことを確認します(存在する場合、動物は反応します)。全身麻酔の状態を達成するために、必要に応じて麻酔レベルを調整します。注:適切な全身麻酔を維持するために、必要に応じてイソフルランを滴定します。. 術後鎮痛のために1.2 mg / kgのブプレノルフィン徐放性(ER)を皮下投与します。.マウスを仰臥位にして前肢と後肢を伸ばし、手足をテープで固定します。次に、手術用の滅菌フィールドを準備します。注意: 呼吸が妨げられないように、固定されているときは前肢がリラックスしていることを確認してください。 温かい滅菌生理食塩水とベタジン綿棒で腹部を各綿棒を交互に3回準備します。腹部を無菌的にドレープします。 2.肝切除術 メスを使用して、剣状突起から恥骨上領域までの皮膚を縦正中線開腹切開術にします。次に、鋭利なハサミでリネアアルバを切開して腹腔に入り、この切開部を皮膚切開の長さまで延長します。注:最初に、肝臓が腹壁に深くある剣状突起下領域でリネアアルバを切開して、下にある腸の損傷を防ぐ方が安全です。 適切なリトラクターを使用して腹壁を横方向に引っ込めます。次に、剣状突起を止血器で固定し、胸骨を上方向に引っ込めて肝臓を露出させます。 肝臓を下方向に引っ込めて鎌状靭帯を露出させ、次に鋭利なハサミを使用して肝臓の長さに沿って靭帯を横断します。肝臓を胸部に向かって上方に引っ込めて、肝胃靭帯と肝内葉靭帯を露出させ、鋭利なマイクロハサミを使用してこれらの構造を横断します。注:グリッソンのカプセルでカプセル化された肝臓は非常に壊れやすく、打撲傷や裂傷がしやすいため、収縮は湿った綿の先端のアプリケーターで非常に穏やかに行う必要があります。 左ローブを元の解剖学的位置に保ちながら、中央ローブを上方向に引っ込めます。LLの上内側部分に5-0シルク縫合糸を巻き付け、LLを胸部に向けて上向きに反射させて葉の下面を露出させ、葉の基部で縫合糸の端をまとめ、縫合糸を基部で結びます。縫合糸を結紐してLLを結紮する前に、縫合糸が下大静脈(IVC)または門脈の血流を妨げないことを確認してください。注:この縫合糸は、LLが胸部に向かって上向きに反射しているときに結束し、結紮中にポータルトライアドが十分に露出するようにするのが最善です。これにより、隣接する構造を損なうことなく、基部に近い葉の切除が容易になります。 鋭利なハサミを使用して縫合糸のタイのすぐ遠位にあるLLを切除し、組織の小さなカフ(~2 mm)が切除された葉の端から縫合糸を分離することを確認します。止血を確認します。 中央葉を胸部に向かって上向きに反射させ、MLの基部の周りに5-0のシルク縫合糸を配置し、MLを元の解剖学的位置に戻します。縫合糸の端をMLの上面の基部に近似し、葉の基部でそれらを結びます。結紮されたMLを切除し、縫合タイの周りに残存組織の小さなカフを残します。止血を確認します。 肝臓を右から左に動員して右上葉と下葉を露出させ、これらの葉を内側と下に注意深く反映させます。RULの上内側面に5-0縫合糸を巻き付けて、縫合糸がRUL基部を取り囲むようにし、次にRULを胸部に向けて反射させます。縫合糸をRULの下に巻き付け、端をその基部近くに結び付けてから、縫合糸の結束の周りに残りの組織の小さな袖口を残して切除します。注: RUL の基部で近位に結びすぎると、RLL への血液供給が損なわれ、RLL の虚血を引き起こし、術後 24 時間以内にマウスが死亡する可能性があります。対照的に、RUL基部から遠位に結びすぎると、肝臓腫瘤の切除量が減少し、それによって術後生存率が予想以上に増加します。 残りの肝臓を安静時の解剖学的位置に戻して、止血を確保します。必要に応じて、切除した肝縁の軽度の出血の領域にガーゼで圧力をかけます。. 5-0ポリグラクチン縫合糸を使用して、正中線腹壁(筋膜と筋肉層)を中断なく閉じます。ステープルまたは5-0モノフィラメント縫合糸で皮膚切開を閉じます。 麻酔を中止し、マウスが意識を取り戻し、正常に歩行できるようになるまでマウスを監視します。 3. 術後ケア 術後にマウスを観察して、適切な回復(つまり、マウスが目を覚まし、警戒し、ケージ内で歩行している)と痛みのコントロールを確認します。マウスは、手術後6時間まで2時間ごとに、その後は毎日検査します。注: 術後、マウスはケージ内でゆっくりと動くことが予想されます。マウスは、他のマウスから隔離されたケージで回復し、完全に回復したときにのみ他のマウスの会社に戻る必要があります。 マウスが感覚不良の液体または手術による過度の失血により血液量減少になった場合は、温めた生理食塩水注射(0.1-1.0 mL、皮下または腹腔内)を投与します。.

Representative Results

78% の延長肝切除術が成功すると、8 週齢16 週齢の健康な成体マウスで 1 週間以内に 50% の死亡率が誘発されると予想されます。適切に実施されれば、最小限の失血が期待されます。持続する残留出血は、手動圧力で制御できます。手術後24時間以内の周術期死亡は、多くの場合、技術的なエラーによって引き起こされます。技術的な失敗には、大きな血管への不注意な損傷が…

Discussion

マウスで50%の致死率を引き起こす拡張78%肝切除術を成功させるには、各肝葉を正確に切除することが重要です。このレベルの能力と精度は、手順を繰り返し実行することによってのみ達成できます。トレーニング曲線はオペレーターによって異なりますが、通常は3〜6か月の練習が必要です。TLMの78%未満を切除する肝臓切除は生存率が高く、TLMの78%以上を切除する肝臓切除は致死率が高くな?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

HL086741 DK063275 PBとTAは、NHLBI T32トレーニング助成金HL007734からNRSAフェローシップの受賞者です。

Materials

2 x 2 Gauze Covidien 2146 Surgery: dissection
5-O Nylon Monofilament Suture Oasis 50-118-0631 Surgery: Skin closure
5-O Silk Suture Fine Science Tools 18020-50 Surgery: liver lobe ligation
5-O Vicryl Suture Ethicon NC9335902 Surgery: Abdominal wall closure
Addson Forceps Braintree Scientific FC028 Surgery: dissection
Alcohol Swabs (2) BD 326895 Disinfectant
Buprenorphine Extended Release Formulation  Zoopharm N/A Analgesia
Cordless Trimmer Braintree Scientific CLP-9868-14 Shaving
Curved Forceps Braintree Scientific FC0038 Surgery: dissection
Hemostat Braintree Scientific FC79-1 Surgery: dissection
Isoflurane Inhalant Anesthetic  Patterson Veterinary RXISO-250 General Anesthesia
Magnet Fixator (2-slot) (2) Braintree Scientific ACD-001 Surgery: to hold small retractors
Magnet Fixator (4-slot)  Braintree Scientific ACD-002 Surgery: to hold small retractors
Microscissors Braintree Scientific SC-MI 151 Surgery: dissection
Operating tray Braintree Scientific ACD-0014 Surgery: for establishment of surgical field 
Povidone Iodine 10% Swabstick (2) Medline MDS093901ZZ Disinfectant
Scalpel (15-blade) Aspen Surgical Products 371615 Surgery: dissection
Sharp Scissors (Curved) Braintree Scientific SC-T-406 Surgery: dissection
Sharp Scissors (Straight) Braintree Scientific SC-T-405 Surgery: dissection
Small Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-118 Surgery: dissection
Tissue Forceps (Straight x2) Braintree Scientific FC1001 Surgery: dissection
Warming Pad (18" x 26") Stryker TP 700 Warming
Warming Pad Pump Stryker TP 700 Warming
Wire Handle Retractor (2)  Braintree Scientific ACD-005 Surgery: to facilitate exposure of peritoneal cavity
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia System Braintree Scientific EZ-108SA General Anesthesia: Contains Isoflurane vaborizer & console, Induction chamber, Regulator/Hose, Facemask (M)

参考文献

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記事を引用
Brennan, P., Patel, N., Aridi, T., Zhan, M., Angolano, C., Ferran, C. Extended 78% Hepatectomy in a Mouse Surgical Model. J. Vis. Exp. (207), e66528, doi:10.3791/66528 (2024).

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