概要

ヒト骨肉腫組織を用いた患者由来異種移植マウスモデルの樹立

Published: March 22, 2024
doi:

概要

本プロトコールは、ヒト骨肉腫組織を用いて患者由来異種移植片(PDX)マウスモデルを確立する方法を記載している。

Abstract

骨肉腫は、小児および青年期に最もよくみられる原発性悪性骨腫瘍です。近年、新たな治療計画が策定されているにもかかわらず、骨肉腫患者の予後は大きく改善していません。したがって、忠実度の高い堅牢な前臨床モデルを確立することが重要です。患者由来異種移植片(PDX)モデルは、各患者のヒト悪性腫瘍の遺伝的、エピジェネティック、および不均一な特性を忠実に保存します。その結果、PDXモデルは、形質転換研究におけるさまざまながんを研究するための本物の in vivo モデルと見なされています。この記事では、ヒト骨肉腫の形態学的特徴を正確に反映したPDXマウスモデルを作成および維持するための包括的なプロトコルを紹介します。これには、新たに切除されたヒト骨肉腫組織を免疫不全マウスに直ちに移植し、その後、連続的に継代することが含まれます。記載されているモデルは、骨肉腫の成長、薬剤耐性、再発、および転移を研究するためのプラットフォームとして機能します。さらに、標的治療薬のスクリーニングと個別化治療スキームの確立を支援します。

Introduction

骨肉腫は、骨間葉細胞に由来する原発性骨悪性腫瘍であり、青年および小児に最も多くみられます。これはしばしば長骨幹の骨端に発生し、悪性度が高く、早期転移、予後不良を特徴としています1,2。肺転移は、骨肉腫患者の主な死因です。非転移性骨肉腫患者の5年生存率は65%-70%3です。しかし、過去40年間で、転移性骨肉腫患者の5年生存率(わずか20%)は有意に改善しておらず、骨肉腫患者の25%が診断時に転移を持っています4。現在、骨肉腫治療の第一選択薬はコンセンサスに達していますが、化学療法のレジメンと治療時間には依然として大きな違いがあります5。より効果的な化学療法レジメンを得るためには、適切な動物モデルに基づく前臨床試験を行うことが重要です。

現在、骨肉腫の前臨床実験に一般的に使用されるモデルには、細胞株ベースのin vitro細胞培養およびin vivo細胞由来異種移植片(CDX)、および患者由来異種移植片(PDX)6,7が含まれます。

これらの細胞株は、培養やin vitro研究での使用、または免疫不全マウスへの移植によるCDXモデル8の確立に便利です。しかし、in vitroで培養した細胞株は、継代を繰り返す間にin vitro培養環境に適応するために生じる可能性のある突然変異により、悪性腫瘍の不均一性や患者の個々の特性を正確に反映できない場合があります。さらに、in vivoでの腫瘍の成長と発生に必要な微小環境と免疫系を欠いています。CDXモデルはin vitro細胞培養に比べていくつかの利点がありますが、CDXモデルから得られた腫瘍組織は、in vitroで培養された細胞株と比較して腫瘍内の不均一性および免疫系の表現が限られているにもかかわらず、骨肉腫患者の個々の特性を完全に反映していない可能性があります9。そのため、忠実度の高い前臨床モデルを確立することが重要です。

PDXモデルでは、切除したばかりのヒトがん組織を免疫不全マウスに直ちに移植します。この方法により、マウスで連続的に経過した後でも、各患者のヒト悪性腫瘍の遺伝的、エピジェネティック、および不均一な特性を忠実に保存することができます。さらに、PDXモデルは、その後の臨床転帰10を正確に予測することが知られており、個別化された治療法を作成し、精密医療研究を前進させるための貴重なツールとなっています11

この研究では、ヒト骨肉腫組織を移植することにより、免疫不全マウスにPDXモデルを確立する手順について説明します。このようなモデルは、骨肉腫の前臨床実験を実施するためのプラットフォームとして機能します。

Protocol

ヒト組織を対象としたすべての研究は、上海中医薬大学(中国・上海)傘下の龍華病院の制度倫理審査委員会によって承認されており(2013LC52)、ヘルシンキ宣言に基づき、患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。この動物実験のIACUC番号はPZSHUTCM221017013です。4週齢の雄 CAnN.Cg-Foxn1nu/Cllマウスに、ダブルライオン照射げっ歯類食GB 14924.3と滅菌?…

Representative Results

このプロトコルは、PDXマウスモデルを確立するための詳細な手順を説明し、新たに切除されたヒト骨肉腫組織の即時移植とマウスでの連続継代後のヒト骨肉腫の形態学的特徴を保存します。今回、ヒト骨肉腫組織を用いてPDXマウスモデルを確立することに成功しました。 図3A は、15歳の患者から大腿骨肉腫組織を移植した2?…

Discussion

PDXモデルは、ヒトの癌の特性をシミュレートし、遺伝的およびゲノム的変化、組織型、不均一性、および遺伝子発現プロファイル16,17,18,19を含む原発腫瘍との類似性をより保持することができる。したがって、彼らは癌患者の分子表現型と遺伝子型を保存し、生物学を研?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、(1)国立自然科学財団(81973877および82174408)からの助成金によってサポートされています。(2)上海最優先研究センター建設プロジェクト(2022ZZ01009);(3)中国の国家重点研究開発プログラム(2020YFE0201600);(4)上海コラボレーティブイノベーションセンター、病院TCM準備の産業変革、および(5)上海伝統中国医学大学の予算内の研究プロジェクト(2021LK047)。

Materials

10% formalin neutral solution Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd G1101-500ml Fix the tissues
Autoclave Japan Hiryama Company HVE-50 Sterilization surgical instruments
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. / Animal
Caliper Yantai Green Forest Tools Co., Ltd. 034180A Measure the tumor volume
Dish (60mm) Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd 430166, Corning Sample placment during transplantation
Disinfectant cotton balls Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. 20230627 Disinfect the skin of mice
Disposable sterile gloves Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. YT21131 Sterile operation
Double lion Irradiated Rodent Diet Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd. GB 14924.3 Animal feed
Electronic scale Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd 1-2000 Weigh the weight of the tumor
Eosin Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd E4009-25G Hematoxylin eosin stain
Hematoxylin Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd H3136-25G Hematoxylin eosin stain
Isoflurane Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd VETEASY Mouse anesthesia 
IVCs mice cage Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd. HH-MMB-2 Animal barrier
Mark pen Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. YYST5 Mark the surgical incision
Olympus Optical microscope Japanese Olympus Company BH20 Scan tissue slices
Ophthalmic ointment Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd SOICOEYEGRL Avoid dry eyes of mice during anesthesia
Ophthalmic scissors Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd Y00030 JZ Cut the skin
Ophthalmic tweezers Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd BS-ZER-S-100 Biosharp Hold osteosarcoma tissues during transplantation
Paraffin Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. 80200-0015 Buried osteosarcoma tissue
Paraffin slicing machine Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd. RM2235 Osteosarcoma tissue section
physiological saline Guangzhou Jinsheng Biotechnology Co., Ltd. 605-004057 Rinse and temporary storage of osteosarcoma tissue
Scalpels Surgical Instrument Factory of Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. J11010-10# JZ Separation of osteosarcoma tissue and making surgical incisions
Sterile hood Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. ECO0.9 Surgical operation table
sterile surgical drapes Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. 20160090 Provide sterile surgery area
Straight needle holder Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd J31050 JZ Suture the wound
Suture line Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd F3124 Suture the wound
Suture needle Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd F3124 Suture the wound
Tissue protective solution Nanjing Shenghang Biotechnology Co., LTD BC-CFM-03 Maintain the activity of tissue cells
Tube (50 mL) Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. BLD-BL2002500 Install formalin fixation solution

参考文献

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記事を引用
Sun, X., Chang, J., Zhou, C., Zhao, P., Guo, S., Tong, J., Wang, Y., Yang, Y. Establishment of Patient-Derived Xenograft Mouse Model with Human Osteosarcoma Tissues. J. Vis. Exp. (205), e66491, doi:10.3791/66491 (2024).

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