概要

成体Xenopusにおける6つの重要な臓器を迅速にサンプリングする技術

Published: February 16, 2024
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概要

この記事では、成人 のXenopus で迅速かつ簡単にアクセスできる6つの重要で多様な臓器(心室、肝葉、膵臓、脂肪体、対になった腎臓、皮膚)をサンプリングするためのガイドを提供します。

Abstract

Xenopus は、100年以上にわたり、脊椎動物の発達と疾患を理解するための強力なモデル生物でした。胚の実験的分析および解剖技術は十分に文書化されていますが、成体の Xenopus の構造と器官の説明は、成体と協力するための技術とともに、定量的プロテオミクスやシングルセルトランスクリプトミクスなどの最新のアプローチの要件を考慮に入れて更新されていません。細胞型および遺伝子中心の視点では、胚期と成体組織での観察を対照的に行う必要があります。幼虫の臓器は、幼虫から成虫への移行全体にわたって、特に大規模な変態リモデリング中に、全体的な構造、形態、および解剖学的位置に大きな変化を遂げます。臓器の同定と解剖のための強固な基準を確立することは、異なる研究所で実施された研究から得られたデータセットの一貫性を確保するために重要です。現在のプロトコルでは、成人の Xenopusの6つの臓器を特定し、心臓の解剖とサンプリングの方法を実証しています 心臓室、肝臓、脂肪体、膵臓、対になった腎臓、および成人 のXenopusの皮膚。保存方法にもよりますが、解剖した臓器は、定量的プロテオミクス、単一細胞/核トランスクリプトミクス、 in situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、組織学などに使用できます。このプロトコルは、組織サンプリングを標準化し、成体臓器系のマルチラボ調査を促進することを目的としています。

Introduction

「成体のXenopusのデジタル解剖」は利用可能ですが1、成体のXenopusの複製可能な臓器および組織サンプリングは、他の成体モデル(例:マウス2,3,4)に利用可能な詳細な指示がなければ依然として困難です。この記事は、現在幼虫利用可能なものと同様に、成虫Xenopusの正確で複製可能な臓器サンプリングのための明確なガイダンスを提供することを目的としています5。完成のしやすさに重点が置かれ、最大限の鮮度を維持し、すべてのユーザーがプロトコルにアクセスできるようにします。

Rana sp.6の徹底的な解剖ガイドや、他の無尾類7の教室解剖ガイドは多数ありますが、Xenopusの解剖とサンプリングのガイドは現在利用できません。サンプリングの実践や両生類の解剖学に詳しくない人のために説明すると、Xenopusと他の無尾類とのわずかな違いにより、これらのリソースは複製可能な組織サンプリングには最適ではありません。

多くの貴重な組織は含まれておらず、現在のガイドには廃棄されています。これは、組織の鮮度を確保するためです。6つのサンプルは、ユーザーの経験やスキルレベルに関係なく、心臓が鼓動し始めてから1時間以内にこれらの組織を収集できることを保証するのに十分な制限があります。他の多くの組織を収集するためのより高度で詳細なガイドは、個別のコンパニオンペーパーとして準備中です。

経験の浅いユーザーの場合、このプロトコルは、交換が困難な動物(トランスジェニック、高齢の動物など)をサンプリングする前に、実験以外の理由で安楽死させられる動物で最初に試みることを常にお勧めします。理想的には、サンプリングされたすべての動物が健康であり、雌の場合は過去2週間に排卵していないことが望ましい。

Protocol

すべての実験は、ハーバード大学医学部のIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)の規則と規制に従って行われました。代表的な結果は、灌流された成熟したアルビノの雄と灌流されていない成熟アルビノの雄 Xenopus laevisの両方について示されています。 1. 実験の準備 注:サンプリング前に灌流プロトコル8</su…

Representative Results

図1から図20を利用し、このプロトコルのすべてのステップに従うことにより、心室、肝臓の左葉、膵臓、左脂肪体、対になった腎臓、および皮膚のフラップを安楽死から1時間以内にきれいに切除しました。この時間内に、図21に示すように、サンプルが現れるようにサンプルをすすぎ、トリミングします。 <p class="jove_conte…

Discussion

このプロトコルは鮮度を最大限に高めることを目的としているため、サンプルによっては望ましくない組織が含まれている場合があります。たとえば、肝膵管と一部の腸間膜は膵臓でサンプリングされ、一部の腹膜組織、副腎、および尿管は常に対になった腎臓でサンプリングされます。 鮮度が問題にならない場合は、修正された技術を使用してより正確なサンプリングを実現できます。</p…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIHのODグラントR24OD031956によって支援されました。Samantha Jalbert、Jill Ralston、Cora Andersonの支援とサポート、および有益なフィードバックを提供してくださった編集者と匿名の査読者に感謝します

Materials

5x Magnifying Glass with LED Light and Stand amazon.com B08QJ6J8P1 light must not produce heat
Disposable Transfer Pipets VWR 414004-036
Dissecting Fine-Pointed Forceps Fisher Scinetific 08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" VWR 76457-374
Dissection Tray Fisher Scinetific 14-370-284 styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container US Plastic  Item 2860 alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid US Plastic  Item 3047
Iridectomy Scissors 6" vwr 470018-938 iris scissors are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine) Pentair AES TRS1
PBS 1x Corning 21-040-CV
Sodium Bicarbonate, Powder, USP Fisher Scientific 18-606-333
Specimen Forceps, Serrated VWR 82027-442
T-Pins for Dissecting Fisher Scinetific S99385

参考文献

  1. Porro, L. B., Richards, C. T. Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography. J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).
  2. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).
  3. Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).
  4. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice – Part 3 – A joint publication of the RITA and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).
  5. Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. Xenopus tadpole tissue harvest. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).
  6. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a Frog (Rana sp.). Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).
  7. O’Rourke, D. P. Amphibians used in research and teaching. ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).
  8. Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Effective rapid blood perfusion in Xenopus. JoVE. (issue), e65287 (2023).
  9. Balls, M., Worley, R. S. Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus. Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).
  10. Holz, P. H., Raidal, S. R. Comparative renal anatomy of exotic species. Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).
  11. Trott, K. A., et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis). Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).
  12. Fremont-Rahl, J. J., et al. Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs. Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).
  13. Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).
  14. Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol. Herpetol. , 35-81 (2009).

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記事を引用
Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus. J. Vis. Exp. (204), e66489, doi:10.3791/66489 (2024).

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