DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。
DNAおよびRNA配列(分析物)を検出するためのDNAzymeベースのナノマシン(DNM)は、オリゴヌクレオチドで作られた多機能構造です。その機能には、緊密な分析物の結合、選択性の高い分析種の認識、蛍光レポーター基質の複数の触媒切断による蛍光シグナル増幅、およびセンサー応答の増加のための蛍光基質引力が含まれます。機能ユニットは、共通のDNAスキャフォールドに取り付けられ、協調的な働きをします。RNA切断10-23 DNMは、非触媒ハイブリダイゼーションプローブと比較して感度が向上しています。DNMの安定性と基質認識の可能性の増加は、二本鎖DNAフラグメントであるタイルによってもたらされます。DNMは、フォールドRNAと二本鎖DNAで一塩基が異なる2つの分析種を区別し、他のタンパク質フリーハイブリダイゼーションプローブよりも~1000倍低い濃度で分析種を検出できます。この記事では、DNA-ナノマシン活性の診断可能性の背後にある概念と、核酸検出アッセイにおけるDNMの設計、組み立て、およびアプリケーションの概要を示します。
核酸検出の最も初期の方法の1つは、分析されたRNAまたはDNA配列への選択的オリゴヌクレオチドの相補的結合です。この方法では、標的DNAまたはRNA分析物1とWatson-Crick塩基対を形成できる核酸フラグメント(プローブ)を使用します。次に、複合体は、さまざまな手法によって分析物および非結合プローブと区別されます。ノーザンブロッティング、 in situ ハイブリダイゼーション、またはqPCRなどの特定の方法は、相補的結合2の現象に基づいています。最も一般的なハイブリダイゼーションプローブには、感度が低い(マイクロモルからナノモルレベルに達する)ことと、点変異を含む一塩基変異(SNV)に対する選択性が低いという2つの重大な欠点があります。この問題は、これらの欠点の解決策が互いに矛盾するため、洗練されたアプローチが必要です3。最高の選択性を得るためには、検出するオリゴヌクレオチドを、不適合な分析種と不安定なハイブリッドを形成するのに十分な短さに保つ必要があります。このような短いオリゴヌクレオチドは、標的核酸にしっかりと結合できず、その二次構造をほどくことができないため、検出可能なシグナルが得られないことがよくあります。生物学的RNAや二本鎖DNA(dsDNA)中のCGリッチフラグメントを検出することは特に困難です。一方、長いプローブはSNV3の影響を受けません。デッドロックを打破するために、バイナリプローブの概念が開発されました4。
バイナリセンサーは、1つの検出プローブを2つに分割し、その断片を特殊化し、そのうちの1つをヘアピンをほどいたりdsDNAに侵入したりするために長く保ちます。第2のバイナリプローブフラグメントは、塩基の不一致に対して感度を高めるために短いままであり、したがってSNVを検出する手段を提供する。2つのバイナリセンサー部品が結合されている場合、信号が生成されます4。全複合体は、FRET5、分子ビーコンプローブ6,7、またはペルオキシダーゼ様活性8,9,10のG-四重鎖、またはRNA切断11,12,13 DNAzymeを介して可視化することができる。10-23 DNAzymeコアを備えたバイナリセンサーについては、十分に説明されています。これらは、合成的に作成された一本鎖核酸フラグメント11、または一本鎖増幅産物14,15を検出するように適合されています。例えば、細胞培養物から抽出された16S rRNAの場合、この分子は細胞12,16に豊富に存在するため、増幅を伴わない検出も可能です。10-23 DNAzyme コアを備えたバイナリセンサーは、鉛イオン17 などの非核酸検出にも適合させることができます。それにもかかわらず、低感度は依然としてバイナリ10-23 DNAzymeセンサの主要な欠点の1つであると考えられており、この問題に対処するために、カスケード18または代替のシグナル増強方法19を含む様々なアプローチが開発されてきた。残念ながら、上記の手法はセンサー部品のコストと不安定性を大幅に増加させるため、実用化されていません。
この研究で記述された実験は、DNA-ナノマシン(DNM)20,21と呼ばれる10-23 DNAzymeベースのDNA-ナノセンサーを使用する。これらの構造には、バイナリセンサーと、(1)バイナリプローブに隣接するDNAファシリテーター、構造化領域を巻き戻して二本鎖DNAに侵入するDNAファシリテーター、(2)すべてのDNM部品を近接して保持し、シグナル形成の可能性を高めるDNAタイルが含まれます(図1)。全体として、10〜23 DNAzymeベースのDNMは、検出限界(LOD)をピコモル範囲21まで減少させる。これらは、細胞溶解物中の16rRNAを検出するために使用することができる22、または増幅せずにウイルスRNAの存在を報告するために23,24。同時に、DNMはSNVに対して感受性を保ち、ヘテロ接合体25の対立遺伝子の遺伝子型決定にさえ使用することができる。DNM法は、製品の可視化や、高い選択性を持つ複雑な混合物中の製品の同定のために、あらゆる増幅タイプを補完する技術として使用できます。DNM は、従来の TaqMan プローブや beacon プローブとは異なり、サンプルの加熱を必要としないため、エンドポイント検出プロトコルに使用でき、全体的な検出コストを有効にします。
この記事では、DNMの in silico 開発について説明し、DNMの組み立てと機能特性評価の手順を示します。この研究は、ウイルスDNA(OR652423.1)の13972-14154位に対応するエプスタイン・バーウイルス(EBV)の合成断片を用いて行った( 資料表参照)。
DNAマシンの設計は簡単ですが、ハイブリダイゼーションプローブや機能的なDNAナノ構造の設計にはある程度の経験が必要です。分析種のフラグメントをできるだけ短く保つことで、二次構造の数を減らし、二次構造へのDNM浸潤を簡素化することが適切です。CG含有量は、安定した分子内構造を避けるために、できれば60%未満である必要があります。DNMの組み立ては、?…
The authors have nothing to disclose.
著者らは、EBVのgDNAを提供してくださったEkaterina V. Nikitina氏に感謝します。Muhannad Ateiahさん、Maria Y. Berezovskayaさん、Maria S. Rubelさんは、ロシア連邦教育科学省(助成金番号:FSER-2022-0009)とPriority 2030プログラムに感謝の意を表します。
1.5 mL tube | Biofil | CFT011015 | |
100 bp+ DNA Ladder | Evrogen | NL002 | |
100-1000 µL pipette | Kirgen | KG-Pro1000 | |
10-100 µL pipette | Kirgen | KG-Pro100 | |
1-10 µL pipette | Kirgen | KG-Pro10 | |
20-200 µL pipette | Kirgen | KG-Pro200 | |
2-20 µL pipette | Kirgen | KG-Pro20 | |
4x Gel Loading Dye | Evrogen | PB020 | |
Acrylamide 4K | AppliChem | A1090,0500 | |
Ammonium persulfate | Carl Roth | 2809447 | |
Biorender | Biorender | https://www.biorender.com | |
Bisacrylamide | Molekula | 22797959 | |
Boric Acid | TechSnab | H-0202 | |
ChemiDoc imaging system | BioRad | 12003153 | |
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate | Corning | COS3915 | |
DinaMelt | RNA Institute | http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php | |
EDTA | Amresco | Am-O105 | |
Ethidium bromide | BioLabMix | EtBr-10 | |
HEPES | Amresco | Am-O485 | |
Magnesium chloride | AppliChem | 131396 | |
Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658001EDU | |
pipette 10 µL tips | Kirgen | KG1111-L | |
pipette 1000 µL tips | Kirgen | KG1636 | |
pipette 200 µL tips | Kirgen | KG1212-L | |
Pixelmator Pro | Pixelmator Team | https://www.pixelmator.com/pro/ | |
Potassium chloride | Carl Roth | 1782751 | |
PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
RNAse/DNAse free water | Invitrogen | 10977049 | |
Sealing film for PCR plates | Sovtech | P-502 | |
Sodium chloride | Vekton | HCh (0,1) | |
Spark multimode microplate reader | Tecan | Spark- 10M | |
T100 amplificator | BioRad | 10014822 | |
TEMED | Molekula | 68604730 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Amresco | Am-O497 | |
UNAFold | RNA Institute | http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php | |
Water bath | LOIP | LB-140 | |
Oligos used | |||
Analyte: | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC |
|||
Tile-Arm3: | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT |
|||
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT |
Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA |
Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1 |
DNA-Syntez | direct order, HPLC purification |