タンパク質間相互作用などの生体分子の相互作用は、生体機能の分子基盤です。特に関連する相互作用を欠く相互作用ヌル/障害のある変異体を分離できれば、この相互作用の機能を理解するのに大いに役立ちます。この記事では、interaction-null/障害のある変異体を効率的に分離する方法を紹介します。
タンパク質間相互作用は、生命現象の根底にある最も基本的なプロセスの1つです。特定のタンパク質間相互作用の役割と機能を理解する最も簡単で最良の方法の1つは、野生型(関連するタンパク質間相互作用を持つ)の表現型と、関連する相互作用を欠く突然変異体の表現型を比較することです。したがって、そのような突然変異体を単離することができれば、関連する生物学的プロセスの解明に役立ちます。酵母ツーハイブリッド(Y2H)法は、タンパク質間相互作用を検出するだけでなく、相互作用ゼロ/障害のある変異体を単離するための強力なアプローチです。この記事では、Y2H技術を使用して相互作用ヌル/障害のある変異体を単離するためのプロトコルを紹介します。まず、ポリメラーゼ連鎖反応と効率的なシームレスクローニング技術を組み合わせてミューテーションライブラリを構築し、空のベクターをライブラリから効率的に排除します。次に、相互作用がゼロ/障害のある変異体をY2Hアッセイによってスクリーニングします。Y2Hベクトルのトリックにより、フレームシフトやナンセンス変異を持つ変異体などの望ましくない変異体は、スクリーニングプロセスから効率的に排除されます。この戦略は単純であるため、2ハイブリッドシステムによって相互作用を検出できるタンパク質の任意の組み合わせに適用できます。
生体分子間の相互作用は、生命現象の最も基本的な部分です。タンパク質間相互作用は、そのような相互作用の重要な部分を構成します。したがって、目的のタンパク質/遺伝子の機能をさらに解明するためには、目的のタンパク質の相互作用パートナーを特定することが重要です。酵母ツーハイブリッド(Y2H)法は、 in vivo1でタンパク質間相互作用を同定するための一般的な手法です。このシステムでは、相互作用が試験される2つのタンパク質(XとY)が、それぞれDNA結合(DB)ドメインと転写活性化ドメイン(AD)に融合します。DB-X融合タンパク質は、DBドメインの認識配列に結合します。したがって、タンパク質XとYが相互作用すると、AD-Y融合タンパク質は認識配列の近接性になります。その結果、認識配列の下流にあるレポーター遺伝子の転写が活性化されます。したがって、レポーター遺伝子活性の有無を用いて、タンパク質間相互作用の有無を決定することができる1。
目的のタンパク質の特定の相互作用パートナーが特定されたら、相互作用の生物学的機能を解明するために、さらなる分析を行う必要があります。この目的のために、特定のタンパク質間相互作用を損なう、または除去するタンパク質の変異体を単離できれば、それらは強力なツールとして機能します。Y2Hシステムは、野生型の「相互作用陽性」クローンから始めて、「相互作用陰性」クローンをスクリーニングすることにより、そのような変異体を単離するために直接使用できます。このプロセスを加速するために、「逆」Y2H(rY2H)システムが開発されました2,3。rY2Hシステムでは、宿主酵母株はレポーター遺伝子としてカウンター選択可能なマーカー遺伝子を保有しており、AD-Yタンパク質とDB-Xタンパク質が相互作用しない場合にのみ酵母細胞が増殖します。
Y2HシステムとrY2Hシステムの両方で相互作用陰性の変異体の単離が可能ですが、スクリーニングによって得られたすべての候補が目的のタイプの変異(通常はミスセンス変異)を持っているわけではないため、変異体を単離するプロセスは面倒です。最も深刻な問題は、候補のかなりの割合がフレームシフトまたはナンセンス変異を保有しており、望ましくないクローンを除外するためにウェスタンブロッティングを行う必要があることです。この問題を解決するために、新しいプラスミドベクターが開発されました4。これらのベクターでは、薬剤耐性マーカーであるKanMXは、DBドメインまたはADの下流にアウトオブフレームに配置されています。マーカー遺伝子は、目的の遺伝子が挿入された場合にのみ、DBドメインまたはADとインフレームになります。目的の遺伝子にランダムな突然変異が導入されると、フレームシフトまたはナンセンス変異を有するものなどの望ましくない突然変異体は、薬剤耐性選択を行うことによって容易に排除することができ、望ましいミスセンス変異を有する候補は、Y2Hスクリーン4で容易に同定することができる。この記事では、この戦略を使用して目的のタンパク質の相互作用ゼロ/障害のある変異体を単離するためのプロトコルを紹介します。
この記事では、Y2Hアッセイを使用して相互作用欠損/障害のある変異体を単離する方法について説明します。このような変異体は、目的のタンパク質の機能を解析するための強力なツールです。このような変異体を単離するために、Y2H宿主株2,3を改変することにより、rY2Hアッセイが以前に開発されました。しかし、労働量は大きく減っていません。…
The authors have nothing to disclose.
Y2Hの技術改良を行ったのは田中祐輔です。本研究は、日本学術振興会科研費JP22K06336および大阪発酵研究所の支援を受けて行われました。
0.5 M EDTA (8.0) | Nacalai Tesque Inc. | 14347-21 | |
10% SDS Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 313-90275 | |
2-mercaptoethanol | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 135-07522 | |
2-propanol | Kishida Chemical Co. Ltd. | 110-64785 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 021-07852 | |
Agar | Formedium | AGR60 | |
Ampicillin Sodium | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 68-52-3 | |
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT | Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. | M180-7 | |
DNA from salmon testes | Merck KGaA. | D1626 | |
Ethanol | Merck KGaA. | 9-0770-4-4L-J | |
Filter paper for colony lift (Grade 50) | Whatman, Cytiva | 1450-090 | |
Filter paper for colony lift (No.4A) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 01411090 | |
Filter paper for replicaplating (No.1) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 00011150 | |
G-418 Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 075-05962 | |
Hydrochloric acid | Kishida Chemical Co. Ltd. | 230-37585 | |
KCl | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 163-03545 | |
Lithium Acetate Dihydrate | Nacalai Tesque Inc. | 20604-22 | |
MgSO4•7H2O | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 131-00405 | |
Na2HPO4•12H2O | Nacalai Tesque Inc. | 10039-32-4 | |
NaCl | Nacalai Tesque Inc. | 31319-45 | |
NaH2PO4•2H2O | Nacalai Tesque Inc. | 31717-25 | |
Paper towel | AS ONE Corp. | 7-6200-02 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | Nacalai Tesque Inc. | 25970-56 | |
Plasmid DNAs | the National BioResource Project – yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml) | ||
Plasmid isolation Kit | Nippon Genetics Co. Ltd. | FG-90502 | |
Polyethylene Glycol #4,000 | Nacalai Tesque Inc. | 11574-15 | |
SC double drop-out mix -Leu -Trp | Formedium | DSCK172 | |
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly ) | Takara Bio Inc. | #639648 | |
Skim milk powder | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 190-12865 | |
Streptomycin Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 3810-74-0 | |
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes) | Promega Corp. | M7122 | |
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane | Formedium | TRIS01 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque Inc. | 12967-45 | |
Tryptone | ThermoFisher scientific Inc. | 211705 | |
Tween 20 | Nacalai Tesque Inc. | 35624-15 | |
Yeast Extract | ThermoFisher scientific Inc. | 212750 | |
Yeast Nitrogen Base (YNB) | Formedium | CYN0210 | |
Zymolyase 100T | Nacalai Tesque Inc. | 07665-55 |