新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法

1. 原液調製 カルセインストック溶液を調製する際は、溶液を暗所に保管することで写真の劣化を防ぎます。マグネシウムまたはカルシウムを含まない、ダルベッコのPBS中のカルセインの1 mM溶液を調製します14。5 mLの1 mMカルセイン溶液の場合、3.1 mgのカルセイン(622.5 g / M)を5 mLのダルベッコPBSに加えます。.カルセインの1 mMソックスを使用して、 表1に詳述されているように、マイクロチューブ内の二次ストック溶液の1 mLアリコートを調製します。 19 mgのFAS六水和物(392.1 g / M)を5 mLのダルベッコPBSに溶解して、10 mMの硫酸第二鉄アンモニウム(FAS)溶液を得ることにより、硫酸第二鉄アンモニウム六水和物ストックを調製します。FASの二次ストックを希釈して調製します。2 mM FAS(fA)のストックを調製するには、10 mM FASストックの200 μLをPBSで希釈し、800 μLのDulbecco’s PBSで希釈します。100 μM FAS(fB)のストックを調製するには、50 μLのストックfAを950 μLのダルベッコPBSで希釈します。 10 mMのデフェリプロンストックを調製するには、2.8 mg(139.15 g / M)を2 mLのダルベッコPBSに溶解します。.10 mMストックの200 μLを800 μLのダルベッコPBSで希釈して、2 mM鉄キレート剤の二次ストックを調製します。注:このアッセイでは、選択した鉄キレート剤は、マグネシウムまたはカルシウムを含まないダルベッコPBSに溶解する必要があります。作業の例として、鉄キレート剤のデフェリプローンを使用しました。 2. カルセイン蛍光の線形範囲の決定によるアッセイの検証 ストック溶液表( 表1を参照)に記載されているように、1 mMから1 μMの範囲のカルセインストックを調製します。光化学的な劣化を防ぐために、ストック溶液は暗所に保管してください。 90 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を、シングルチャンネル手動ピペットまたはマルチチャンネル手動ピペットを使用して、96 ウェルプレートのウェル A から H および 1 から 12 にピペットで移します。 シングルチャンネル手動ピペットを使用して、1 mM Calceinストック10 μLを96ウェルプレートの列12、行AからHに加えます。 シングルチャンネルマニュアルピペットを使用して、あらかじめ調製した800 μMカルセインストック(表1)10 μLをカラム11の列AからHの96ウェルプレートに加えます。 表1のストックで添加手順を繰り返し、カラム10に400μMのストックを10μL、カラム9に200μMストックの10μLなどを含めます。カラム 2 に 1 μM ストックが 10 μL 含まれるまで、カラム全体でこの段階的な手順を続けます。注:各ウェル中のカルセインの最終濃度は、1:10の希釈により、ストック溶液よりも10倍低くなっています。 10 μL の PBS を列 1 の A 行から E まで加えます。 室温で30分間インキュベートし、マイクロプレートリーダー上の分析装置を励起490 nm、検出530 nm(またはカルシアン蛍光に適したフィルターセット)に設定します。 3. Fe2+ イオンクエンチングによるカルセイン蛍光の低減のためのアッセイバリデーション 10 μM の Calcein (cB) ストックと 2 mM の FAS ストック (fA) を調製します ( 「材料の表」を参照)。カルセインストックは、光劣化を防ぐために暗所に保管してください。 シングルチャンネル手動ピペットまたはマルチチャンネル手動ピペットを使用して、50 μL の PBS を列 2 から 10、行 A から E に添加します。PBSを11列目に追加しないでください。 シングルチャンネル手動ピペットを使用して、2 mMのFAS(fA)ストック100 μLをカラム11(行AからE)の96ウェルプレートに加えます。 マルチチャンネル手動ピペットを使用して、カラム11から50μLのfAを除去し、すでにカラム10にあるPBSにピペットで移し、ピペッティングで十分に混合します。 この段階的な二重希釈手順を96ウェルプレートの列9〜2、行A〜Eにわたって続け、ピペッティングで混合します。 カラム2からピペッティングして溶液50 μLを取り出し、溶液を廃棄します。 溶液が入ったすべてのウェル(列2〜12、行A〜E)に40μLのPBSを加えます。 90 μL の PBS をウェル列 1 の行 A から E に添加します。これらのウェルは、1 μM カルセインと 0 μM FAS のポジティブコントロールとして機能します。 溶液が入った各ウェル(列1〜12、行A〜E)に10 μLの10 μMカルセインストック(cB)を加えます。この結果、カラム 11 の最高濃度は 1000 μM FAS となり、カラム 10、9、8 からカラム 2 にかけて FAS 濃度は半減します。カラムから得られた各ウェルには、1 μM のカルセインと希釈された FAS が含まれています。 PBS単独コントロールについては、列1〜5の行FにPBS100μLを添加します。FAS単独制御のために、列6から10の行Fに2 mMのFASを100 μL加えます。暗所で室温で10分間インキュベートします。 励起490 nm、検出530 nmに設定されたマイクロプレートリーダー(またはカルセイン蛍光に適したフィルターセット)で分析します。 4. 鉄キレート剤がFe 2+イオンについて弱いキレート剤カルセインを凌駕する能力を定量化するためのアッセイ 表1に示すように、カルセインストック(cB)10 μM、FASストック(fB)100 μM、鉄キレート剤ストック2 mMを調製します。カルセインの在庫は、光分解を防ぐために暗闇に保管してください。 シングルチャンネル手動ピペットまたはマルチチャンネル手動ピペットを使用して、96ウェルプレートの列2〜10、行A〜Eに50μLのPBSを追加します。PBSを11列目に追加しないでください。 鉄キレート剤の2 mMストック(fA)100 μLを、シングルチャンネル手動ピペットを使用して、列11、行AからEの96ウェルプレートに加えます。 マルチチャンネル手動ピペットを使用して、カラム 11 から 50 μL の fA を除去し、カラム 10 の A 行から E の PBS にピペットでピペットで入れ、ピペッティングで完全に混合します。 この段階的な二重希釈手順をプレートの残りの列9〜2、行A〜Eにわたって続け、ピペッティングにより各ウェルを混合する。カラム 2 から 50 μL を取り出して廃棄します。これにより、96ウェルプレートの列11〜2、行A〜Eにわたって2mMの鉄キレート剤(デフェリプロン)が2mMで希釈されます。 溶液が入ったすべてのウェル(例:列2〜11行AからE)に30μLのPBSをピペットで入れます。 マルチチャンネルピペットを使用して、10 μL の 100 μM FAS ストック (fB) を列 2 から 12 の列 A から E に加えます。これにより、各ウェル中の濃度は 1 μM のカルセインと 10 μM の FAS となり、キレート剤は 2 倍希釈され、プレート (カラム 11-2) 全体で各カラムの濃度が半減し、カラム 11 ウェル A から E の鉄キレート剤の濃度は 1000 μM になります。 マルチチャンネルピペットを使用して、10 μL の 10 μM カルセインストック (cB) を列 2 から 12 の列 A から E に加えます。 PBS80 μL、カルセインストック(cB)10 μL、FASストック(fB)10 μLをピペットで1列目のA-E列にピペットで移します。ピペッティングでサンプルを混合します。これにより、1 μM カルセインを 10 μM FAS で制御し、キレート剤は使用しません。 PBS100μLをF列1から5列にピペットで移します。これにより、PBSネガティブコントロールが提供されます。 2 mMの鉄キレート剤(デフェリプロン)100 μLをF列6〜10列に加えます。これにより、キレート剤のみの制御が可能になります。 暗所で室温で10分間インキュベートします。490 nm で励起、530 nm で検出するように設定されたマルチモーダルマイクロプレートリーダー(またはカルシアン蛍光に適したフィルターセット)で分析します。 5. データ分析 カルセイン蛍光の線形範囲の決定によるアッセイバリデーションのための分析。ステップ 1 の 96 ウェルプレートの列にあるカルセインの各濃度について、行 A-H の平均相対蛍光単位 (RFU) を計算し、濃度に対してプロットします。X 軸のカルセイン濃度の折れ線グラフと Y 軸の平均 RFU をプロットし、線形回帰を使用して最適な線を提供します。 各列(2-11)のカルセイン濃度を列1の行AからEのPBSのコントロールと比較することにより、統計的有意性を定量化します分散分析(ANOVA)を実行し、最小有意差(LSD)を使用してp<0.001のしきい値で事後分析を適用し、統計的有意性を決定します( 図1の**で示されます)。 Fe2+ イオンクエンチングによるアッセイバリデーションのための解析で、カルセインの蛍光を低減します。列 2 から 11 の FAS の各濃度について、行 A から E の平均相対蛍光単位 (RFU) を計算します。各FAS濃度の平均RFUをy軸にプロットします。X軸では、Log2スケールを使用してFASの濃度をプロットし、データをより適切に分散させます。線形回帰を使用して最適な直線をプロットします。 PBS、1 μM カルセイン、0 μM FAS (列 1 行 A から E) のコントロールの各列平均から平均 RFU までを比較することにより、統計的有意性を定量化します。LSDのポストホック分析で分散分析をp <0.001のしきい値で実行し、統計的有意性を判断します。 アッセイのための分析:鉄キレート剤がFe2+ イオンについて弱いキレート剤カルセインを凌駕する能力を定量化します。列 2 から 11 のキレート剤の各濃度について、行 A から E の平均相対蛍光単位 (RFU) を計算します。各キレート剤濃度の平均RFUをy軸上にプロットします。x軸では、データをよりよく分布させるため、Log2スケールを使用してキレート剤の濃度をプロットします。 PBS 1 μM Calcein と 10 μM FAS のコントロールの各列平均 RFU (列 1 行 A から E) を比較することにより、統計的有意性を定量化します。LSDのポストホック分析で分散分析をp <0.001のしきい値で実行し、統計的有意性を判断します。