機械的ストレス下での細胞の挙動の探索は、細胞力学とメカノバイオロジーの進歩にとって極めて重要です。蛍光マイクロピペット吸引(fMPA)技術は、制御された機械的刺激と単一細胞における細胞内シグナル伝達の包括的な解析を組み合わせた新しい方法です。この手法は、生細胞メカノバイオロジーの新しい詳細な研究を調査します。
マイクロピペット吸引アッセイは、長い間、生細胞力学の研究の基礎となっており、機械的ストレスに対する細胞の応答に関する洞察を提供してきました。この論文では、蛍光結合マイクロピペット吸引(fMPA)アッセイの革新的な適応について詳しく説明します。fMPAアッセイは、イオンチャネルによって媒介される生細胞のメカノトランスダクションプロセスを同時にモニタリングしながら、正確な機械的力を投与する機能を導入します。洗練されたセットアップには、精密に設計されたホウケイ酸ガラス製マイクロピペットが、細かく調整された貯水槽と空気圧吸引システムに接続されており、1mmHg±まで細かく刻みで制御された圧力適用を容易にします。重要な機能強化は、落射蛍光イメージングの統合であり、吸引中の細胞形態学的変化と細胞内カルシウムフラックスの同時観察と定量化を可能にします。fMPAアッセイは、落射蛍光イメージングとマイクロピペット吸引の相乗的な組み合わせにより、機械的に困難な環境下での細胞メカノセンシングの研究に新たな基準を打ち立てます。この多面的なアプローチは、さまざまな実験設定に適応可能であり、シングルセルのメカノセンシングメカニズムに関する重要な洞察を提供します。
細胞挙動の世界で次々と発見が明らかになり、接着、移動、分化などの動的な細胞活動を決定する上で、張力、流体せん断応力、圧縮、基質の剛性などの機械的刺激が果たす役割が強調されています。これらの機械生物学的側面は、細胞が生理学的環境とどのように相互作用し、応答し、さまざまな生物学的プロセスに影響を与えるかを解明する上で最も重要です1,2。
過去10年間、マイクロピペットベースの吸引アッセイは、機械的刺激に対する多様な細胞応答を研究するための汎用性の高いツールとして際立っています。この手法は、細胞の弾性率、剛性、皮質張力など、単一細胞レベルでの生細胞の本質的な機械的特性に関する貴重な洞察を提供します。これらのアッセイにより、細胞膜の張力、細胞膜にかかる圧力、皮質の張力など、さまざまな機械的パラメータを測定できます(表1に要約)。野心的な力を研究することで、特に断片化、伸長、出芽などの膜動態の領域において、それらが細胞の機能とプロセスにどのように影響するかについての理解が深まりました3,4。
機械的パラメータ | 形容 | 独創的なアプローチ |
セルの剛性(Cell Stiffness) | 細胞の機械的剛性と弾性の測定。 | 細胞膜の吸引と陰圧に対する変形応答の解析20,21. |
接着強度 | 細胞が表面にどれだけ強く接着するかの評価。 | 付着した細胞を基質から剥離するための制御された吸引の適用2,22。 |
膜張力 | 細胞膜内の張力またはストレスの評価。 | 加えられた圧力23,24に応答する膜変形の測定。 |
粘 弾性 | 細胞の粘性と弾性を組み合わせた挙動の特性評価。 | 吸引に対する時間依存変形応答の解析23,25. |
変形 能 | 細胞の形状がどれだけ簡単に変化できるかの決定。 | 制御された吸引下での変形の程度の評価20,24。 |
表面張力 | 細胞表面の張力の測定。 | マイクロピペット膜突起部26を形成するのに必要な圧力の評価。 |
細胞-材料相互作用 | 細胞と材料または基質との相互作用の研究。 | 異種物質と接触する細胞の吸引と相互作用の観察2,24. |
細胞間相互作用 | 隣接細胞間の相互作用の検討 | 細胞群の吸引と細胞間力の解析27. |
表1:マイクロピペット吸引アッセイによって特徴付けられる機械的パラメータ。
マイクロピペットベースの吸引技術は、赤血球(RBC)の研究に広く使用されており、循環器系における赤血球の機能を理解するために不可欠な赤血球の変形性やさまざまな機械的特性を評価しています。赤血球は驚くべき適応性を示し、複雑な毛細血管ネットワークや内皮間裂を通過する際の変形に対する機械的汎用性を維持します5,6。この旅の間、赤血球は0.5〜1.0μmの狭い通路を横断しなければならず、引張や圧縮7,8,9を含む多数の機械的力にさらされます。また、循環中の血流によって発生するせん断応力に対しても高い感度を有する10。これらのプロセスは、機械的刺激に対する細胞応答において確立された役割を持つ重要なシグナル伝達イベントであるカルシウム流入を含む調節メカニズムの活性化を促進します11,12。カルシウムを介したメカノセンシングを支配する複雑なメカニズムは、現在進行中の研究の魅力的なテーマです。
これに関連して、fMPAは、精密に制御された機械的力の下でのカルシウム動員の程度を明らかにするための効果的なアプローチであり、機械的調節(マイクロピペット吸引システムを使用)とカルシウム強度の視覚化(蛍光インジケーターを使用)を同時に適用できます。特に、赤血球が狭窄した血管を通って移動する生理学的シナリオを模倣しています。特筆すべきは、当社が開発したfMPAシステムが1mmHgの分解能で圧力を発生させることです。実装された高速度カメラは、100msの時間分解能とサブミクロンメートルレベルの空間分解能を実現できます。これらの構成により、生細胞に機械的力を正確に適用し、同時に結果として生じる細胞シグナル伝達を捕捉することができます。さらに、このセットアップの統合的工学的性質により、マイクロピペット吸引アッセイは他の機器や技術を補完するために容易に適応することができ、細胞力学の複雑さをさらに探求することができます。この汎用性は、このアプローチのさらなる利点です。
マイクロピペット吸引アッセイは、細胞バイオメカニクスの深遠な複雑さを探るために、実質的な圧力調節、正確な空間オーケストレーション、信頼性の高い時間的識別力を駆使して、洗練された方法論を具現化しています。この研究は、さまざまな刺激下で赤血球が示す微妙な機械感受性反応を明らかにするための重要なツールとしてのfMPAの適用に特に重点を置きます。明視野信号と蛍光…
The authors have nothing to disclose.
Nurul Aisha Zainal Abidin氏とLaura Moldovan氏には、追加のドナー募集、採血、瀉血のサポートに感謝します。機器と試薬を整理してくれたTomas Anderson氏とArian Nasser氏に感謝します。この研究は、オーストラリア研究評議会(ARC)のディスカバリープロジェクト(DP200101970-L)から資金提供を受けました。A.J.);オーストラリア国立保健医療研究評議会(NHMRC)のアイデア助成金(APP2003904-L。A.J.);NHMRC機器助成金-LAJ;ニューサウスウェールズ州心臓血管能力開発プログラム(初期-中期キャリア研究者助成金-LAJ);NSW CVRN-VCCRI研究イノベーション助成金;Office of Global and Research Engagement(シドニー・グラスゴー・パートナーシップ・コラボレーション・アワード-L.A.J.);L.A.J.は、National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2(105863)およびSnow Medical Research Foundation Fellow(2022SF176)です。
µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
DAQami | Diligent | ||
Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
Imaris | Oxford Instruments | ||
Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation – 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water – Final pH = 8-9. |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation – 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water – Final pH = 8-9. |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) |
Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation – 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |