この原稿では、マウスの眼から網膜グリアMüller細胞を単離するための詳細なプロトコルについて説明しています。プロトコールは、マウスの眼の除核と解剖から始まり、続いてMüller細胞の単離、播種、および培養が行われます。
網膜の主要な支持細胞は、網膜グリアミュラー細胞です。それらは網膜表面全体を覆い、網膜血管と網膜ニューロンの両方に近接しています。ミュラー細胞は、その増殖により、神経伝達物質、レチノイン酸化合物、イオン(カリウムK+など)の取り込みとリサイクルなど、健康な網膜でいくつかの重要な役割を果たします。血流を調節し、血液網膜関門を維持することに加えて、それらはまた、網膜への代謝と栄養素の供給を調節します。この原稿では、マウスMüller初代細胞を単離するための確立された手順を紹介しています。眼疾患のさまざまなマウスモデルに関与する根底にある分子プロセスをよりよく理解するために、ミュラー細胞単離は優れたアプローチです。この原稿では、マウスからのミュラー細胞単離の詳細な手順を概説しています。除核から播種まで、全体のプロセスは約数時間続きます。播種後5〜7日間は、単離された細胞が妨げられずに成長できるように、培地を変更しないでください。次に、形態学と異なる免疫蛍光マーカーを用いた細胞の特性評価が、このプロセスの次となります。細胞の最大継代回数は3〜4倍です。
ミュラー細胞(MC)は、網膜組織に見られる主要かつ最も豊富なグリア細胞です。彼らは、網膜1内の構造的完全性と代謝機能を提供する主要なプレーヤーです。MCの戦略的な構造は、網膜の厚さ全体に広がっているため、網膜をサポートします。足場のような特性に加えて、それらは網膜ニューロンの代謝機能を持ち、グルコースや乳酸などのエネルギー基質を供給します。これらの機能は、健康な神経機能を維持するために重要です。MCの障害は、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、緑内障など、さまざまな網膜疾患の一因となることが報告されています2,3。MCは、網膜の再生治療のための内因性細胞源となり得る1。それらはまた、網膜のかなりの部分を占めており、強力な証拠は、いくつかの種で、これらの細胞が欠落しているニューロンを置換するために刺激され得ることを示唆している2。それらはニューロンと有益に協力し、円錐状に分岐するミュラー細胞の端足が血管を密に引き抜き、網膜の神経成分をつなぎます。ニューロンの発達とニューロンの可塑性を維持するために、ミュラー細胞はニューロンの柔らかい基質として機能し、ニューロンを機械的外傷から保護します3。さらに、病理学的状況下では、ミュラー細胞は、失われた光受容体およびニューロンを複製または再生する神経前駆細胞または幹細胞に分化することがある2,3,4。ミュラー細胞は、自己複製や分化のためのさまざまなレベルの可能性など、網膜幹細胞の特性を保持しています5,6。ミュラーグリア細胞は、神経栄養因子を産生し、神経伝達物質を取り込み、リサイクルし、イオンを空間的に緩衝し、網膜を恒常性に保つために血液網膜関門を維持する重要な網膜系統を有する7,8,9。このことは、網膜変性症に関連する疾患を治療するための細胞ベースの治療における有望なツールとしてのミュラー細胞の可能性を浮き彫りにしています。ミュラー細胞は、網膜全体に分布する主要なグリアであり、ニューロンと血管の両方につながっています。それらは重要な保護的役割を果たし、網膜細胞の生存率と安定性を維持するために不可欠な構造的および代謝的サポートを提供します。残念ながら、網膜からの初代ミュラー細胞単離に関する文献には、非常に少ないプロトコルが見つかっています10,11。
私たちは、マウス初代ミュラー細胞を確実に単離し、培養するための強化されたアプローチを紹介します。このプロトコルは、野生型C57BL/6マウスおよびトランスジェニックマウス12,13からMüller細胞を単離するために、我々のグループで使用された。このプロトコルには、性別の好みがない5〜11日齢のマウスが使用されます。細胞は最大4回継代されています。しかし、P4ではフラスコに付着しなくなり、健康な培養物を育てることが難しくなります。培養物は網膜色素上皮(RPE)細胞で汚染されていることが多いため、細胞株で追加の実験を行う前に、少なくとも1回は細胞を継代する必要があります。継代により、汚染物質からのさらなる分離が可能になります。したがって、提示されたプロトコルは、マウスMüller細胞を単離するための迅速かつ効果的な方法を提供し、その後、治療標的を研究し、網膜疾患の潜在的な治療法を評価するための信頼性の高いプラットフォームとして使用することができます14。
マウスからの一次網膜色素上皮(RPE)の単離は、以前に私たちの研究室によって文書化されました。この原稿では、Müller初代細胞単離の詳細なデモンストレーションプロトコルについて説明します。この手順には、マウスの眼から単離されたMüller細胞の核出術、処理、解剖、収集、播種、培養、および特性評価が含まれます。これは、以前の出版物で見つかった以前に成功したプロトコルと、…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立眼病研究所(NEI)、国立眼病研究所(NEI)基金R01 EY029751-04の支援を受けました。Sylvia B. Smith博士は、このプロトコルがMüller細胞単離のプロトコルに基づいて修正されたバージョンであるため、感謝の意を表します。
Beaker : 100mL | KIMAX | 14000 | |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile | 13-711-20 | ||
DMEM (1X) | Thermo Scientific | 11885084 | Media to grow Müller cells |
Fetal Bovine Serum (FBS) | gibco | 26140079 | For complete Muller cell culture media |
Glutamine synthase | Cell signalling | 80636 | |
Heracell VISO 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL | B-D | 309577 | |
Micro Centrifuge Tube: 2 mL | Grainger | 11L819 | |
Pen Strep | gibco | 15140-122 | For complete Müller cell culture media |
Phosphate Buffer saline (PBS) | Thermo Scientific | J62851.AP | |
Positive Action Tweezers, Style 5/45 | Dumont | 72703-DZ | |
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm | GARANA INDUSTRIES | 2595 | |
Sorvall St8 Centrifuge | ThermoScientific | 75007200 | |
Stemi 305 Microscope | Zeiss | n/a | |
Surgical Blade, #11, Stainless Steel | Bard-Parker | 371211 | |
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style | Corning | 430589 | |
Tissue Culture Dish : 100x20mm style | Corning | 353003 | |
Tornado Tubes: 15mL | Midsci | C15B | |
Tornado Tubes: 50mL | Midsci | C50R | |
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips | Dumont | 501764 | |
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL | Electron Microscopy Sciences Dumont | 50-241-57 | |
Underpads, Moderate : 23" X 36" | McKesson | 4033 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Vimentin | invitrogen | MA5-11883 | |
Zeiss AxioImager Z2 | Zeiss | n/a | |
Zeiss Zen Blue 2.6 | Zeiss | n/a |