概要

マウスからの血管壁常在型CD34+ 幹細胞の免疫磁気的単離

Published: December 22, 2023
doi:

概要

この研究は、血管壁に常在するCD34+ 幹細胞(CD34+ VW-SC)の単離、培養、および機能決定のための安定した効率的な方法を確立しました。このわかりやすく、時間効率の良い分離法は、他の研究者が心血管疾患に関与する潜在的なメカニズムを研究するために利用できます。

Abstract

常在型CD34+ 血管壁常在幹細胞および前駆細胞(VW-SC)は、血管の損傷と修復の調節における重要な役割についてますます認識されています。機能性マウスCD34+ VW-SCを安定的かつ効率的に培養する方法を確立することは、さまざまな生理学的および病理学的条件下でこれらの細胞の増殖、遊走、および分化に関与するメカニズムをさらに研究するために不可欠です。記載された方法は、磁気ビーズスクリーニングとフローサイトメトリーを組み合わせて、初代培養常在CD34+ VW-SCを精製します。その後、精製された細胞は、免疫蛍光染色とCa2+ イメージングによって機能的に同定されます。簡単に説明すると、マウス大動脈および腸間膜動脈の外膜からの血管細胞は、組織ブロックの付着を通じて得られ、続いて細胞数が少なくとも1×107に達するまで継代培養される。続いて、CD34+ VW-SCを磁気ビーズソーティングおよびフローサイトメトリーを用いて精製します。CD34+ VW-SCの同定には細胞免疫蛍光染色が含まれますが、機能的多能性は、細胞を特定の培地に曝露して配向分化させることによって決定されます。さらに、機能的な内部Ca2+ 放出および外部Ca2+ エントリーは、ATP、カフェイン、またはタプシガルギン(TG)に曝露されたFura-2/AM負荷細胞において、市販のイメージングワークステーションを使用して評価されます。この方法は、血管壁に常在するCD34+ 幹細胞の単離、培養、および同定のための安定した効率的な技術を提供し、VW-SCの調節メカニズムに関する in vitro 研究と標的薬物のスクリーニングの機会を提供します。

Introduction

血管壁は、血管の発達、恒常性調節、および血管疾患の進行において極めて重要な役割を果たします。近年、多くの研究により、動脈にさまざまな幹細胞系統が存在することが明らかになっています。2004年、Qingbo Xu教授のグループは、成体血管壁の周辺にCD34、Sca-1、c-kit、およびFlk-11を発現する血管幹細胞/前駆細胞の存在を初めて報告しました。これらの血管幹細胞は、多方向の分化および増殖能を示します。通常の条件下では、彼らは比較的静止したままです。しかし、特定の因子によって活性化されると、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞に分化することができます。あるいは、パラクリン効果を通じて血管周囲マトリックスと微小血管形成を調節し、損傷した血管の修復またはリモデリングを促進することもできます2,3,4,5,6。最近、血管壁に常在するCD34+幹細胞が、大腿動脈ガイドワイヤー損傷後の内皮細胞の再生に関与することが明らかになった2。したがって、CD34+ VW-SCの単離と定量、およびCD34+幹細胞の基本的な生物学的特性の検討は、CD34+ VW-SCの調節に関与するシグナル経路をさらに研究するために重要です。

現在、細胞分離にはさまざまな方法があり、密度勾配遠心分離などの細胞培養特性や細胞の物理的特性に基づく技術など、さまざまな方法が利用可能であり、その結果、多くの非標的細胞を含み、比較的低純度の細胞が選別されます7,8,9,10,11,12 .また、蛍光/磁気支援セルソーティングもよく用いられます。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、高い技術的要件を有する複雑なシステムであり、比較的高価で時間がかかり、ソーティングされた細胞の活性に潜在的に影響を及ぼす13,14。しかし、磁気活性化セルソーティング(MACS)は、回収率と細胞活性が高く、ダウンストリームアプリケーションへの影響が少ないため、より効率的で便利です8。そこで、本プロトコールでは、MACSを適用してCD34+ VW-SCを精製し、さらにフローサイトメトリーにより細胞を同定しました。血管壁幹細胞を研究するためのMACSベースの単離法の確立は非常に貴重です。まず、実験的な遺伝的および細胞生物学的研究を可能にします。第二に、血管壁に常在する幹細胞の効率的な単離と培養により、幹細胞機能を調節するシグナル伝達因子の体系的な評価とスクリーニングが可能になります。第三に、幹細胞における重要な表現型の同定は、細胞の状態を評価する上で重要な「品質管理」を提供します。したがって、精製方法の同定は、血管由来の類似幹細胞への同様のアプリケーションに役立つ可能性があります。

このレポートでは、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色、Ca2+シグナル伝達測定による細胞同定と機能評価など、CD34+ VW-SCの培養のための安定した信頼性の高い方法の詳細なデモンストレーションを提供します。この研究は、CD34+ VW-SCの機能と生理学的および病理学的状態におけるそれらの調節メカニズムに関するさらなる詳細な研究の基礎を提供します。

Protocol

この研究は承認され、動物は中国における実験動物の管理と使用に関するガイドラインに従って取り扱われました。この研究は、動物倫理委員会の承認を得て、動物実験の倫理要件を厳格に遵守しました(承認番号:SWMU2020664)。本研究では、体重18〜20 gの男女の8週齢の健康なC57BL / 6マウスを利用しました。動物は、南西医科大学(SWMU)の実験動物センターに収容されました。 <…

Representative Results

CD34+ VW-SCの単離と精製CD34+ VW-SCsの高純度は、マウス大動脈および腸間膜動脈の外来から、組織付着および磁気マイクロビーズ選別によって得られます。血管壁中のCD34+ 細胞の割合は、一般に10%〜30%である。フローサイトメトリーでは、磁気ビーズソーティングによって得られたCD34+ 細胞の純度が90%以上であることが確認されています(<strong class=…

Discussion

この研究は、マウスの大動脈および腸間膜動脈から機能的なCD34+ VW-SCを取得するための迅速かつ便利な方法を提供します。この方法で得られたCD34+ VW-SCは、増殖活性と多方向分化特性を持っています。三リン酸イノシトール1,4,5-三リン酸受容体(IP3Rs)、リアノジン受容体(RyRs)、および店舗で作動するカルシウムチャネルは、CD34+ VW-SCへのCa2+の放出と侵入?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、中国国家自然科学基金会(No.82070502、31972909、32171099)、四川省四川科学技術プログラム(23NSFSC0576、2022YFS0607)からの助成金によって資金提供されました。著者らは、細胞培養の支援について浙江大学のQingbo Xuに感謝し、著者らは南西医科大学のフローサイトメトリープラットフォームの科学的および技術的支援に感謝します。

Materials

2% gelatin solution Sigma G1393
Anti-CD31 antibody R&D AF3628
Anti-CD34 antibody Abcam ab81289
Anti-c-kit antibody CST 77522
Anti-FITC MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody Abcam ab24313
Anti-Ki67 antibody CST 34330
Anti-PDGFRα antibody Abcam ab131591
Anti-Sca- 1 antibody Invitrogen 710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC eBioscience  Invitrogen 11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC eBioscience  Invitrogen 17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383 Miltenyi Biotec 130-117-775
cell culture hood JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD  SW-CJ-2FD
Centrifuge   CENCE   L530
CO2 incubators             Thermofisher Scientific 4111
Confocal laser scanning microscope  Zeiss  zeiss 980  
DMEM High Glucose Medium ATCC 30-2002
EBM-2 culture medium Lonza CC-3162
FACSMelody   BD Biosciences
FACSMelody™ System  BD
Fetal bovine serum Millipore ES-009-C
FM-2 culture medium ScienCell 2331
Fura-2/AM  Invitrogen M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488  Thermofisher Scientific    A32731
Leukemia inhibitory factor Millipore LIF2010
Microscope  Olympus IX71
MiniMACS   Starting Kit Miltenyi Biotec 130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution Beyotime C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Pharmingen 553141
Stereo Microscope  Olympus SZX10 
TILLvisION 4.0 program   T.I.L.L.Photonics GmbH polychrome V 
VWF Monoclonal Antibody (F8/86) Thermofisher Scientific  MA5-14029
β-Mercaptoethanol Thermofisher Scientific 21985023

参考文献

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記事を引用
Han, C., Xie, C., Dang, Q., Zhang, X., Li, C., Yang, Y., Cheng, J., Li, P. Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice. J. Vis. Exp. (202), e66193, doi:10.3791/66193 (2023).

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