쥐 각막의 신경 영양성 각막염 및 신경 재생을 유도하는 세 가지 전략
概要
여기서는 각막을 자극하는 감각 섬유를 손상시키는 세 가지 방법을 제안합니다. 이러한 방법은 생쥐의 축삭 재생에 대한 연구를 용이하게 합니다. 다른 동물 모델에 적용할 수 있는 이 세 가지 방법은 각막 신경 분포 생리학 및 재생 연구에 이상적입니다.
Abstract
각막은 눈을 덮고 있는 투명한 조직으로 선명한 시력에 매우 중요합니다. 그것은 신체에서 가장 신경 분포가 심한 조직입니다. 이 신경 분포는 눈에 감각과 영양 기능을 제공하고 각막을 온전하게 보존하는 데 기여합니다. 이러한 신경 분포의 병리학적 파괴를 신경 영양성 각막염이라고 합니다. 이것은 눈 부상, 수술 또는 질병에 의해 유발될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 클리닉에서 일반적으로 접하는 세 가지 유형의 사례를 요약하는 방식으로 신경 자극에 손상을 입히기 위한 세 가지 프로토콜을 제안합니다.
첫 번째 방법은 안과 버로 상피를 마모시키는 것입니다. 여기에는 상피층, 자유 신경 말단 및 기저하 신경총을 제거하는 것이 포함되며 클리닉에서 수행되는 광굴절 각막 절제술 수술과 유사한 방식으로 수행됩니다. 두 번째 방법은 상피의 무결성을 유지하면서 생검 펀치로 주변부를 절개하여 신경 분포만을 표적으로 합니다. 이 방법은 라멜라 각막 성형술의 첫 번째 단계와 유사하며 신경 분포의 퇴화와 중앙 각막의 축삭의 재성장으로 이어집니다. 마지막 방법은 형광 신경 섬유의 소작 부위를 특이적으로 국소화하는 다광자 현미경을 사용하여 형질전환 마우스 모델의 신경 분포를 손상시킵니다. 이 방법은 자외선에 과도하게 노출되는 광각막염과 동일한 손상을 입힙니다.
이 연구는 각막 신경 분포의 생리병리학, 특히 축삭의 퇴화 및 재생을 조사하기 위한 다양한 옵션을 설명합니다. 재생을 촉진하는 것은 상피 결손이나 각막 천공과 같은 합병증을 피하는 데 매우 중요합니다. 제안된 모델은 신경 재생을 강화하고 질병 진행을 제한하는 새로운 약리학적 분자 또는 유전자 요법을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
눈의 투명한 표면인 각막은 상피, 기질, 내피의 세 가지 층으로 구성되어 있습니다. 이 기관은 신체에서 가장 높은 밀도의 신경 분포를 가지며 주로 삼차 신경절의 안과 분지에서 유래한 감각 섬유(Aδ 및 C 유형)로 구성됩니다. 감각 섬유는 간질 중간의 각막 주변부를 뚫고 표면을 덮기 위해 가지를 뻗는 큰 다발 형태로 침투합니다. 그런 다음 두 갈래로 갈라져 보우만 막을 뚫고 각막 중앙에 소용돌이가 형성되어 쉽게 알아볼 수 있는 기저하신경총을 형성합니다. 이러한 섬유는 상피의 외부 표면에서 자유 신경 말단으로 끝납니다. 그들은 열적, 기계적, 화학적 자극을 전달하고 상피 항상성에 필수적인 영양 인자를 방출할 수 있습니다 1,2. 신경영양성 각막염(NK)은 각막 감각 신경 분포에 영향을 미치는 퇴행성 질환입니다. 이 희귀 질환은 각막 민감도가 감소하거나 상실되어 눈물 생성이 감소하고 각막의 치유 특성이 저하되기 때문에 발생한다3. NK는 상피 결손이 생기는 1기부터 기질 융해 및/또는 각막 천공이 발생하는 3기까지 3단계로 진행된다4.
임상적으로 이 질병의 기원은 다양할 수 있습니다. 환자는 눈의 신체적 손상, 수술 또는 당뇨병과 같은 만성 질환을 통해 각막 신경 분포를 잃을 수 있습니다 5,6. 현재까지 NK의 발병 과정은 잘 알려져 있지 않으며, 시력을 위협하는 이 질환에 대한 치료 옵션은 매우 제한적입니다. 따라서 상피 결손의 특성을 더 잘 이해하여 이러한 섬유의 재생 이면에 있는 메커니즘을 더 잘 이해하고 잠재적으로 촉진할 수 있습니다. 여기서는 생쥐에서 NK를 유발하는 각막 손상의 몇 가지 모델을 제안합니다.
첫 번째 모델은 안구 버가 있는 각막 상피층의 찰과상입니다. 이 모델은 주로 설치류 및 어류와 같은 다른 동물에서 상피의 재생과 관련하여 연구되었습니다 7,8,9 및 각막 치유를 촉진하는 분자10,11을 테스트하기 위해 연구되었습니다. 생리학적으로 상피 세포가 상처를 봉합하는 데 2-3일이 걸립니다. 그러나 신경 분포의 생리적 패턴은 찰과상으로부터 회복하는 데 4주 이상이 걸린다12,13. 수술 중에 안구 버는 기저부 신경총과 섬유의 자유 신경 말단을 포함하는 각막의 상피층을 제거합니다. 이 시술은 눈의 굴절 결손을 교정하기 위해 광굴절 각막절제술(PRK)을 받은 환자와 임상적으로 비교할 수 있습니다. 이 시술은 각막의 상피를 제거한 후 레이저(14)로 기질을 재형성하는 것으로 구성된다. 환자는 수술 후 2년 동안 각막 신경 밀도가 감소하고 수술 후 3개월에서 1년 동안 민감도가 감소하는 등 여러 가지 부작용을 경험할 수 있다15. 수술이 각막 미세환경의 취약성을 유발한다는 점을 감안할 때, 이 모델은 이러한 부작용을 조사하고 더 빠른 신경 재형성을 촉진하여 문제의 부작용을 줄이는 치료 접근법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.
두 번째 모델은 생검 펀치로 각막 주변부의 축삭돌기를 절단하여 중심 신경 분포( 16)의 월러리안 변성을 유도하는 것으로 구성된다. 임상적으로 이 방법은 전방 판상 각막 성형술과 비교할 수 있는데, 이 경우 외과의는 각막의 전방 두께의 일부를 제거하고 이를 기증자 이식으로 대체하기 위해 각막의 부분적인 트레피레이션을 실현한다 17. 판상 각막 성형술 후 환자는 안구 건조증, 각막 신경 분포 상실, 이식 거부 반응 등 여러 가지 증상을 겪을 수 있다18. 각막 신경에 수행된 이 축삭 절제술 모델은 이식 후 발생하는 섬유 퇴행과 축삭돌기 재생의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
세 번째 방법은 레이저로 각막 신경을 손상시키는 것입니다. 마취된 동물의 각막에 다광자 현미경을 사용함으로써, 활성산소종(ROS) 형성의 결과로 광학계에 국한된 신경의 퇴화가 유도되어 DNA 손상과 세포 공동현상을 유발한다19. 이 방법은 자연 자외선(일광 화상)에 과다 노출되어 유발된 각막 광손상을 재현하며, 이는 또한 ROS 형성을 유발하여 DNA 손상을 유발합니다20. 각막 햇볕에 화상을 입은 환자는 상피 세포의 악화로 인해 각막 섬유의 말단을 모두 빼앗기기 때문에 큰 통증을 경험합니다.
여기에 설명된 세 가지 방법은 NK 발병 과정과 축삭 재생을 조사할 수 있도록 설계되었습니다. 쉽게 재현 가능하고 정확합니다. 또한 빠른 회복과 동물의 쉬운 모니터링이 가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신경영양성 각막염은 10,000명 중 5명에게 영향을 미치는 희귀 질환으로 간주됩니다. 그러나 화학적 화상과 같은 신체적 손상이나 당뇨병, 다발성 경화증과 같은 증후군으로 인해 NK를 앓고 있는 사람은 이러한 통계에 포함되지 않는다3. 더욱이, 이 질환은 여전히 현저하게 과소 진단되고있으며22 이 질병의 유병률은 과소평가되고 있다. 환자의 시력을 보존하는 ?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 형질전환 마우스 계통 MAGIC-Markers에 대한 접근에 대해 Karine Loulier 박사에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 프랑스 국립 연구국(ANR-10-INBS-04, “Investments for the future”)이 지원하는 France-BioImaging 국가 인프라의 회원인 RAM-Neuro 동물 핵심 시설과 이미징 시설 MRI에 감사를 표합니다. 이 연구는 ATIP-Avenir 프로그램, Inserm, Région Occitanie, 몽펠리에 대학교, 프랑스 국립 연구 기관(ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale(FRM 재생 의학, REP202110014140) 및 Groupama Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.2 µm seringe filter | CLEARLINE | 51733 | |
| 0.5 mm rust ring remover | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendrof | 30120094 | |
| Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody | Abcam | ab18207 | |
| Antigenfix | Diapath | P0016 | |
| Artificial tear | Larmes artificielles Martinet | N/A | |
| Buprecare | Animalcare | N/A | |
| Cotton swab | Any provider | N/A | |
| Dissecting tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Fluorescein | Merck | 103887 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | |
| Goat serum | Merck | S26 | |
| Head Holder | Narishige | SGM 4 | |
| Heated plate | BIOSEB LAB instruments | BIO-HE002 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Imalgene 1000 | BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992 |
| LAS X software | Leica | N/A | Large volume computational clearing (LVCC) process |
| Laser Chameleon Ultra II | Coherent | N/A | |
| Laser power meter | Coherent | N/A | |
| Leica Thunder Imager Tissue microscope | Leica | N/A | |
| Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope | Zeiss | N/A | |
| Ocry-gel | TVM lab | N/A | |
| Parametric oscillator | Coherent | N/A | |
| Penlights with blue cobalt filtercap | Bernell | ALPEN | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 150318 | Axotomy protocol |
| Petridish | Thermo Scientific | 150288 | Cornea whole-mount processing |
| Rompun 2% | Elanco | N/A | French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980 |
| Sterile biopsy punch 2.5 mm | LCH medical | LCH-PUK-25 | |
| Triton X-100 | VWR | 0694 | |
| Vectashield | EuroBioSciences | H-1000 | Mounting medium |
参考文献
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