ここでは、糖尿病性腎症の治療におけるJiawei Shengjiang San(JWSJS)の作用機序を探求するためのネットワーク薬理学と分子ドッキング技術を説明するプロトコルを紹介します。
私たちは、糖尿病性腎症の治療とネットワーク薬理学の展開におけるJiawei Shengjiang San(JWSJS)の作用を支えるメカニズムを掘り下げることを目指しました。ネットワーク薬理学と分子ドッキング技術を用いて、JWSJSの活性成分と標的を予測し、緻密な「薬物-成分-標的」ネットワークを構築しました。Gene Ontology(GO)とKyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)のエンリッチメント解析を利用して、JWSJSの治療経路と標的を特定しました。分子ドッキング検証のためにAutodock Vina 1.2.0をデプロイし、ドッキング結果を確認するために100nsの分子動力学シミュレーションを実施し、続いて in vivo 動物検証を行いました。その結果、JWSJSは糖尿病性腎症と227の交差する標的を共有し、タンパク質間相互作用ネットワークトポロジーを構築していることが明らかになった。KEGGの濃縮解析では、JWSJSは、脂質とアテローム性動脈硬化症、PI3K-Aktシグナル伝達経路、アポトーシス、HIF-1シグナル伝達経路を調節することにより、糖尿病性腎症を緩和し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ1(MAPK1)、MAPK3、上皮成長因子受容体(EGFR)、およびセリン/スレオニンプロテインキナーゼ1(AKT1)を複数の経路の集合的標的として同定したことが示されました。分子ドッキングは、JWSJSのコア成分(ケルセチン、パルミトレイン酸、ルテオリン)が水素結合を通じて3つの重要なターゲット(MAPK1、MAPK3、EGFR)とのコンフォメーションを安定させることができると主張しました。 In vivo 試験では、JWSJSによる体重の顕著な増加と、糖化血清タンパク質(GSP)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)、ウリジン三リン酸(UTP)、空腹時血糖値(FBG)の低下が示されました。ヘマトキシリンとエオシン(HE)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色と組み合わせた電子顕微鏡法は、p-EGFR、p-MAPK3/1、およびBAXのさまざまな減少を示し、治療されたラットの腎臓組織におけるBCL-2発現の増加を示す、さまざまな程度の腎臓障害を軽減する各治療群の可能性を強調しました。結論として、これらの洞察は、糖尿病性腎症に対するJWSJSの保護効果が、EGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路の活性化の抑制と腎細胞アポトーシスの緩和に関連している可能性があることを示唆しています。
糖尿病(DM)は、糖尿病性腎症(DN)、網膜症、神経障害など、複数のシステムに影響を及ぼし、継続的な高血糖によるさまざまな合併症を引き起こす可能性のある慢性疾患です1。DNはDMの重篤な合併症であり、末期腎疾患(ESRD)の約30%〜50%を占めています2。その臨床症状は微量アルブミン尿症であり、糸球体容積の増加、中双眼間質過形成、および肥厚した糸球体基底膜を特徴とするESRDに進行する可能性があります3。DNの病因は複雑で、完全には解明されていません。血糖値を下げる、血圧を調節する、タンパク尿を減らすなどの臨床方法は、主にその進行を遅らせるために使用されますが、その効果は一般的です。
現在、DN4を治療する特定の薬剤は見つかっていません。しかし、何世紀にもわたって、漢方薬は糖尿病とその合併症の治療に広く使用されており5、 患者の臨床症状を改善し、疾患の進行を遅らせてきました。多成分、多標的、および多経路効果の利点により、漢方薬はDN6の治療のための革新的な薬物源になると期待されています。
「Shengjiang san」は、明代の医師Gong Tingxianによる「Wanbing Huichun」に由来します。「Neifu Xianfang」という本には、Bombyx Batryticatus、Cicadae Periostracum、Curcumaelongae Rhizoma、Radix Rhei et Rhizomeの使用が説明されています。これに基づいて、Hedysarum Multijugum Maxim、Epimrdii Herba、およびSmilacis Glabrae Rhixomaを追加した後、明晰さの増加、濁りの減少、停滞した「熱」の放出、および「気」と血液の調和という盛江山の機能を発揮します7,8。また、脾臓を強化し、腎臓を引き締める効果も高めます。その有効性は、DNの「気」が「生命エネルギー」の不足、過度の乾燥と「熱」、およびトリプルエナジャイザー7,8によって引き起こされる「熱」の停滞により、順不同で上昇および低下する病因と一致しています。
以前の臨床研究では、中国の漢方薬がDMとその合併症の治療に使用されていることが示されており、jiawei shengjiang san(JWSJS)は、血糖値と脂質を調節し、タンパク尿を減らし、早期DN7患者の臨床効果を大幅に改善することが示されています。JWSJSがDNラットの尿中タンパク質と血糖値を低下させる能力は、以前の研究によって確認されています。これはおそらく、TXNIP/NLRP3およびRIP1/RIP3/MLKLシグナル伝達経路を阻害し、足細胞ピロトーシスを減少させ、DNラットの腎組織における壊死性アポトーシスを予防することによって起こり、したがって腎保護を達成する9。JWSJSは、DNラットのネフリンおよびポドシンタンパク質の発現をアップレギュレートし、足細胞の損傷を軽減することができるため、JWSJSが足細胞の損傷に対して阻害効果があることが示唆されます。JWSJSには、安全性プロファイルが良好な特定の抗DN効果がありますが、それに関する研究はほとんどなく、この研究は主にピロトーシスと壊死性アポトーシスに焦点を当てています。文献は十分に深くない、または体系的ではありません10。これまでの知見から、JWSJSはDNラットのタンパク尿を減少させ、腎障害を緩和することが確認されている7。しかし、JWSJSのDN治療のメカニズムに関する研究は少なく、深化や体系化に欠けています。そこで、本研究は、ネットワーク薬理学を用いてJWSJSのDN治療における分子性物質と作用機序を解析し、今後の研究の基盤となることを目的としています。
ネットワーク薬理学は、ケモインフォマティクス、ネットワーク生物学、バイオインフォマティクス、薬理学など、薬物作用のメカニズムを研究するための新しい方法です11,12。ネットワーク薬理学の研究デザインは、伝統的な漢方薬の全体論的概念と非常によく似ています13,14、そしてそれは漢方薬のメカニズムを研究するための重要な方法です。分子ドッキングは、分子間の相互作用を研究し、それらの結合パターンと親和性を予測できます。分子ドッキングは、コンピュータ支援薬物研究の分野における重要な技術として浮上しています15。したがって、この研究では、ネットワーク薬理学および分子ドッキング法を通じてJWSJS-DN-標的相互作用ネットワークを構築し、JWSJSによるDN治療のさらなる探求のための信頼性の高い理論的基盤を提供します。
私たちの研究では、ネットワーク薬理学、分子ドッキング、および in vivo 動物モデルの組み合わせを採用しました。重要なステップは、「薬物-成分-標的」ネットワークの確立であり、これはDNの治療におけるJWSJSの潜在的なメカニズムを特定するために重要であり、特にEGFR/MAPK3/1シグナル伝達経路との相互作用に焦点を当てていました。
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The authors have nothing to disclose.
本研究は、中国河北省自然科学基金会(第H2019423037号)の一般プロジェクトの支援を受けて行われました。
2×SYBR Green qPCR Master Mix | Servicebio, Wuhan, China | G3320-05 | |
24-h urine protein quantification (UTP) | Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering | N/A | |
3,3'-Diaminobenzidine | Shanghai Huzheng Biotech, China | 91-95-2 | |
Automatic biochemical analysis instrument | Hitachi, Japan | 7170A | |
Anhydrous Ethanol | Biosharp, Tianjin, China | N/A | |
BAX Primary antibodies | Affinity, USA | AF0120 | Rat |
BCL-2 Primary antibodies | Affinity, USA | AF6139 | Rat |
BX53 microscope | Olympus, Japan | BX53 | |
Chloroform Substitute | ECOTOP, Guangzhou, China | ES-8522 | |
Desmond software | New York, NY, USA | Release 2019-1 | |
Digital Constant Temperature Water Bath | Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China | DK-8D | |
EGFR Primary antibodies | Affinity, USA | AF6043 | Rat |
Embed-812 RESIN | Shell Chemical, USA | 14900 | |
Fasting blood glucose (FBG) | Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering | N/A | |
FC-type full-wavelength enzyme label analyser | Multiskan; Thermo, USA | N/A | |
GAPDH Primary antibodies | Affinity, USA | AF7021 | Rat |
Glycated serum protein (GSP) | Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering | N/A | |
Transmission electron microscope | Hitachi, Japan | H-7650 | |
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution | Servicebio, USA | G1003 | |
Image-Pro Plus | MEDIA CYBERNETICS, USA | N/A | |
Real-Time PCR Amplification Instrument | Applied Biosystems, USA | iQ5 | |
Irbesartan tablets | Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals | N/A | |
Isopropanol | Biosharp, Tianjin, China | N/A | |
JWSJS granules | Guangdong Yifang Pharmaceutical | N/A | |
Kodak Image Station 2000 MM imaging system | Kodak, USA | IS2000 | |
Low-density cholesterol (LDL-C) | Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering | N/A | |
MAPK3/1Primary antibodies | Affinity, USA | AF0155 | Rat |
Medical Centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China | TGL-16K | |
Mini trans-blot transfer system | Bio-Rad, USA | N/A | |
Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad, USA | N/A | |
NanoVue Plus Spectrophotometer | Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden | 111765 | |
p-EGFR Primary antibodies | Affinity, USA | AF3044 | Rat |
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution | Servicebio, USA | G1008 | |
p-MAPK3/1 Primary antibodies | Affinity, USA | AF1015 | Rat |
Secondary antibodies | Santa Cruz, USA | sc-2357 | Rabbit |
Streptozotocin | Sigma, USA | S0130 | |
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit | GeneCopeia, USA | QP056T | |
TriQuick Reagent | Solarbio, Beijing, China | R1100 | |
Ultra-Clean Workbench | Suzhou Purification Equipment, China | SW-CJ-1F |