פילמור שני פוטונים הדפסה תלת-ממדית של התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה מיקרוני
概要
הדפסה תלת ממדית בקנה מידה מיקרומטרי מאפשרת אב טיפוס מהיר של התקנים פולימריים עבור תרביות תאים עצביים. כהוכחה עקרונית, קשרים מבניים בין נוירונים הוגבלו על ידי יצירת מחסומים וערוצים המשפיעים על צמיחת נוירוטים, בעוד שההשלכות התפקודיות של מניפולציה כזו נצפו על ידי אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית.
Abstract
תרביות נוירונים היו מודל ניסיוני ייחוס במשך כמה עשורים. עם זאת, סידור תאים תלת-ממדי, אילוצים מרחביים על צמיחת נוירוטים וקישוריות סינפטית מציאותית חסרים. זה האחרון מגביל את המחקר של מבנה ותפקוד בהקשר של מידור ומקטין את המשמעות של תרבויות במדעי המוח. קירוב ex vivo הסידור האנטומי המובנה של קישוריות סינפטית אינו טריוויאלי, למרות היותו המפתח להופעת מקצבים, פלסטיות סינפטית, ובסופו של דבר, פתופיזיולוגיה של המוח. כאן, פילמור שני פוטונים (2PP) משמש כטכניקת הדפסה תלת-ממדית, המאפשרת ייצור מהיר של התקני תרבית תאים פולימריים באמצעות פולידימתיל-סילוקסאן (PDMS) בקנה מידה מיקרומטרי. בהשוואה לטכניקות העתק קונבנציונליות המבוססות על מיקרופוטוליטוגרפיה, הדפסה בקנה מידה זעיר 2PP מאפשרת תפנית מהירה ומשתלמת של אבות טיפוס. פרוטוקול זה מדגים את התכנון והייצור של התקנים מיקרופלואידים מבוססי PDMS שמטרתם לטפח רשתות נוירונים מודולריות. כהוכחה עקרונית, התקן דו-תאי מוצג כדי להגביל פיזית את הקישוריות. באופן ספציפי, צמיחה אקסונלית אסימטרית במהלך התפתחות ex vivo מועדפת ומותרת להיות מכוונת מחדר אחד למשנהו. על מנת לחקור את ההשלכות התפקודיות של אינטראקציות סינפטיות חד-כיווניות, נבחרים מערכי מיקרואלקטרודות מסחריים לניטור הפעילות הביו-חשמלית של מודולים עצביים מחוברים. כאן, שיטות 1) לייצר תבניות עם דיוק מיקרומטר 2) לבצע הקלטות חוץ תאיות במבחנה multisite בתרבויות נוירונים קליפת המוח חולדה מודגמים. על ידי הפחתת עלויות ונגישות נרחבת עתידית של הדפסה תלת-ממדית 2PP, שיטה זו תהפוך לרלוונטית יותר ויותר במעבדות מחקר ברחבי העולם. במיוחד בתחום הנוירוטכנולוגיה ורישום נתונים עצביים בעלי תפוקה גבוהה, הקלות והמהירות של אבות-טיפוס המפושטים במודלים חוץ-גופיים ישפרו את הבקרה הניסויית ואת ההבנה התיאורטית של מערכות עצביות בקנה מידה גדול in vivo .
Introduction
חקירת הפעילות העצבית באורגניזמים מתנהגים מציבה מספר אתגרים. לדוגמה, הגישה הפיזית לרקמת המוח מוגבלת על ידי הצורך לשמור על שלמותה, ולכן האזורים השטחיים של המוח נחשבים בקלות רבה יותר. בידוד מטרות ספציפיות בתוך הרקמה השלמה הוא לעתים קרובות משימה מרתיעה ולפעמים בלתי אפשרית. למרות שתרביות נוירונים הומוגניות מנותקות מציעות גישה נוחה לתכונות המולקולריות, הביוכימיות והביופיזיקליות של רכיבים בודדים (תת-תאיים) של מעגל עצבי, קישוריות מציאותית וארגון אנטומי של המוח השלם הולכים לאיבוד. אילוצים בסיסיים אלה היוו השראה למאמצי המחקר להשיג דרך ביניים, שבה נמנעת מורכבות in vivo בעוד שניתן לבנות את המבנה במבחנה, שהוא לפי דרישה 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בפרט, תרבויות נוירונים מודולריות היו נושא למחקר מקיף בעשורים האחרונים, במטרה להתמודד עם שאלות מפתח של פיזיולוגיה של המוח כמתואר להלן.
ארגון: מחקרי In vivo מראים כי המוח בנוי אנטומית בשכבות עם סוגי תאים מדויקים ומערכי הקרנות. בדיקות פונקציונליות חשפו את ארגון הרשתות העצביות במכלולי צמתים ומודולים, עם סכימות קישוריות מדויקות10,11. עם זאת, תפקידם של מוטיבים של קישוריות ומיקרו-מעגלים אינו יכול להיחקר כראוי in vivo בשל המספר העצום של סינפסות המעורבות, כמו גם ההשפעות השזורות של התפתחות ופלסטיות תלוית פעילות.
העברת אותות: בתרבויות in vivo או אקראיות במבחנה , זה מאתגר להעריך העברת אותות. בחינת ההולכה האקסונלית ופוטנציאל הפעולה לאורכה מחייבת הנחיית צמיחת נוירוט על ידי תפקוד פני השטח או דפוסים כימיים, מתן יחס אות לרעש גבוה בקריאות חוץ-תאיות של פעילות חשמלית12.
רלוונטיות תרגומית: פענוח התפקיד הבלעדי של אלמנטים קדם-סינפטיים לעומת פוסט-סינפטיים על פני תנאים פתולוגיים דורש גישה לאלמנטים אלה בנפרד. תרבויות מודולריות עם קישוריות מוגבלת, המפרידה ביעילות את האלמנטים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים, הן כלים חיוניים למטרה זו13.
קיימות מספר שיטות להשגת צורה כלשהי של מבנה בתרבות העצבית. ניתן לסווג אותם באופן רחב כמניפולציה כימית ופיזיקלית על פני השטח9. השיטות הראשונות 14,15 מסתמכות על הנטייה של תאים עצביים להיצמד לתרכובות (ביו)כימיות מסוימות. זה דורש הפקדת מולקולות דביקות או מושכות על משטח בדיוק בקנה מידה מיקרו ומעקב אחר תבנית מפורטת. בעוד שזה מאפשר כיסוי חלקי של פני השטח של התאים, בעקבות הדפוס הרצוי, שיטות כימיות מוגבלות מטבען ויש להן שיעור הצלחה נמוך יחסית בהנחיית גדילה של נוירוטים16. שליטה מלאה בכיווניות האקסון מחייבת יצירת שיפוע מרחבי של כימיקלים אד-הוק כדי לעצב הנחיה אקסונלית17. השיטות האחרונות כרוכות במניפולציה פיזית על פני השטח ומשמשות בדרך כלל לבניית הרשתות העצביות במבחנה. תאי עצב מוגבלים פיזית במקומות הרצויים על ידי כליאה גיאומטרית, כגון תאים מיקרוסקופיים, קירות, תעלות וכו ‘, המעצבים פולימר תואם ביולוגית כגון polydimethylsiloxane (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 נרפא והתמצק למכשיר מיקרופלואידי. השיטה דה פקטו לייצור מיקרופלואידים PDMS היא פוטוליתוגרפיה רכה21, שבה מסכה דו-ממדית מעוצבת בקנה מידה מיקרו ומשמשת לחריטה סלקטיבית של חומר מבוסס סיליקון בחשיפה לקרינת UV. על קצה המזלג, שרף הניתן לריפוי UV (כלומר, photoresist) מצופה על פרוסת סיליקון באמצעות ציפוי סיבוב, ומגיע לגובה מסוים שנקבע על ידי צמיגותו ומהירות הסיבוב שלו. לאחר מכן, המסכה עם הדוגמה ממוקמת מעל התנגדות האור ונחשפת לאור UV. אזורים שקופים בתוך המסכה, המתאימים לאזורי עניין, יאפשרו לאור UV לגרום להצלבה מקומית של מולקולות הפוטו-התנגדות. האזורים של photoresist לא חשוף נשטפים באמצעות ממס, וכתוצאה מכך היווצרות של תבנית אב. זה משמש שוב ושוב כדי לאפות אלסטומר של הבחירה (כלומר, PDMS), אשר לאחר מכן חרוט עם הגיאומטריות הרצויות בכמה עותקים רצויים. שיטת ייצור כזו היא השיטה הנפוצה ביותר לייצר התקנים מיקרופלואידים22. אולי המגבלות העיקריות של פוטוליתוגרפיה רכה הן תנאי מוקדם להשקעות הון בולטות וחוסר ההיכרות של מעבדות ביולוגיות עם הטכניקות והמומחיות הנדרשות. הכנת המסכה ושלבי הפוטוליתוגרפיה הרכה הנדרשים לתכנון גיאומטריות מורכבות של יחס גובה-רוחב גבוה מרובה גבהים אינן טריוויאליות23 ולעתים קרובות דורשות מיקור חוץ. למרות שהוצעו שיטות חלופיות ודלות תקציב, הן לא תמיד עונות על דרישות הדיוק הגבוהות של אב טיפוס ביולוגי24.
כאן מוצגת שיטת ייצור חלופית, המסתמכת על פילמור שני פוטונים (2PP) וייצור תוספים. זה פשוט ואינו דורש כשלעצמו מומחיות מתקדמת במיקרו-פבריקציה ומיקרופוטוליטוגרפיה. תחום המחקר של מיקרו-ייצור 2PP הופיע בסוף שנות ה-9025, ומאז הוא עד לצמיחה אקספוננציאלית26. עוד על עקרונות היסוד של טכניקה זו ניתן למצוא במקום אחר26. בקצרה, על ידי מיקוד דחף האור העירור במרחב תלת ממדי, 2PP ממנף את התלות הלא ליניארית של בליעת מולטיפוטונים בעוצמה. זה מעניק את היכולת של ספיגה מוגבלת, ומבטיח עירור מדויק וסלקטיבי בתוך אזורים מקומיים מאוד. בעיקרו של דבר, התנגדות אור בגוון שלילי, חומר עם מסיסות מופחתת בחשיפה לאור, נתון לקרן ממוקדת של פעימות לייזר פמטו-שניות במחזור עבודה נמוך27. זה מאפשר דחפים בעוצמות גבוהות בעוצמות ממוצעות נמוכות, מה שמאפשר פילמור מבלי לפגוע בחומר. האינטראקציה של מונומרים רדיקליים המושרים על ידי אור מולידה אוליגומרים רדיקליים, המתחילים פילמור המשתרע לאורך כל הפוטו-התנגדות עד לנפח מובחן, כלומר ווקסל, שגודלו תלוי בעוצמת ומשך פעימות הלייזר28.
בעבודה זו מוצגים שני מרכיבים: A) תכנון וייצור מהיר של תבנית מודפסת בתלת-ממד, הניתנת לשימוש חוזר פעמים רבות כדי לייצר התקנים חד-פעמיים של תרביות תאים עצביים פולימריים (איור 1), ו-B) הצימוד המכני שלהם על פני השטח של מצעי תרבית תאים עצביים מישוריים, או אפילו של מערכי מיקרואלקטרודות משולבי מצע המסוגלים להקליט אותות ביואלקטריים מרובי אתרים.
תכנון בעזרת מחשב של מודל מכני תלת ממדי מתואר כאן בקצרה רבה ומלווה בשלבים המובילים לתבנית מודפסת בתלת-ממד וייצור מכשירי PDMS מפורט גם הוא.
ניתן להשתמש במגוון יישומי תוכנת תכנון בעזרת מחשב כדי ליצור את מודל האובייקטים התלת-ממדי ההתחלתי ולייצר קובץ STL כדי לשלוט בתהליך ההדפסה הדו-PP. בתוך טבלת החומרים, היישומים הראשונים והאחרונים המפורטים הם ללא תשלום או מסופקים עם רישיון חינם. בניית מודל תלת-ממדי דורשת תמיד יצירת סקיצה דו-ממדית, אשר לאחר מכן מושחלת בשלבי המידול הבאים. כדי להדגים רעיון זה, תהליך תכנון תוכנת CAD תלת מימדי גנרי מודגש בסעיף הפרוטוקול, המוביל למבנה העשוי מקוביות חופפות. לקבלת מידע מקיף יותר, מספר הדרכות מקוונות ומשאבי הדרכה ללא תשלום זמינים, כפי שמצוין בטבלת החומרים.
קובץ STL שנוצר מתורגם לאחר מכן לסדרה של פקודות שיבוצעו על-ידי מדפסת התלת-ממד (כלומר, הליך חיתוך). עבור מדפסת תלת-ממד 2PP ספציפית בשימוש, התוכנה DeScribe משמשת לייבוא קובץ STL ולהמרתו לפורמט הקנייני General Writing Language (GWL). הצלחת תהליך הדפסת 2PP תלויה בפרמטרים שונים, ובראשם עוצמת הלייזר ומהירות הסריקה, תפירה ומרחקי בקיעה-חיתוך. הבחירה של פרמטרים אלה, יחד עם הבחירה של אובייקטיבי photoresist, תלוי בתכונות הקטנות ביותר של העיצוב, כמו גם את היישום המיועד. לפיכך, אופטימיזציה של פרמטרים הופכת חיונית כדי לעמוד בדרישות של תרחישי עיצוב שונים ומקרי שימוש. עבור עבודה זו, המתכון המומלץ IP-S 25x ITO מעטפת (3D MF) נחשב כתצורה עבור פרמטרי ההדפסה. בסופו של דבר, חלק מודפס יציב מכנית מודפס ברזולוציה הדרושה תוך מזעור זמן ההדפסה התלת-ממדית שלו.
עיצוב התבנית וקובץ STL הקשור אליו, שהודגם בעבודה זו, מורכב ממסגרת ריבועית להפרדת החלל של תרבית תאים בשני תאים: אזור חיצוני (כלומר, ייקרא מקור לאחר מכן) ואזור פנימי (כלומר, ייקרא טארגט לאחר מכן). שני תאים אלה מחוברים באמצעות קבוצות של מיקרו-ערוצים, שכל אחד מהם מאופיין בגבולות חדים, שנועדו לעכב באופן ספציפי את צמיחת הנוירונים מהמטרה למקור, אך לא להיפך, וככאלה לקדם קישוריות סינפטית כיוונית בין תאי עצב הגדלים בשני האזורים.
מחקרים קודמים השתמשו בגיאומטריות שונות של מיקרו-ערוצים כדי לעודד צמיחה כיוונית של נוירוטים. דוגמאות לכך כוללות צורות משולשות18, מבני גדרות ערוץ19 ותעלות מחודדות20. כאן נעשה שימוש בעיצוב הכולל מחסומי זווית חדים מעבר לגבולות המיקרו-ערוץ, המאופיינים גם בכניסות א-סימטריות. מיקרו-ערוצים אלה משמשים ליצירת המשכיות בין תא סגור, תא המטרה, לבין האזור החיצוני, תא המקור. צורת המשפך של החלק הראשוני של המיקרו-ערוצים, מצד המקור, נועדה לקדם את היווצרותם של צרורות אקסונליים ואת צמיחתם לאורך הנתיב הקצר ביותר, כלומר קו ישר, המחבר בין המקור למטרה. למרחב המשולש הממומש על ידי עמידה מול זוויות חדות יש נפח גדול יותר בצד המטרה כדי לכוון לעיכוב יעיל של נתיבי העצבים תוך העדפת הירי המהיר של צרורות שמקורם במקור ובכיבוש של השטח הפנוי. הבחירה של 540 מיקרומטר לאורך המיקרו-ערוצים מסננת ביעילות את הצמיחה הדנדריטית הקצרה יותרבדרך כלל 39. בנוסף, גובהם 5 מיקרומטר מונע מסומטה התא לחדור דרך המיקרו-ערוצים. בסך הכל, תצורה זו הוכיחה את עצמה כמקדמת קישוריות חד-כיוונית בין מודולי היעד החיצוניים, המקוריים והפנימיים, והיא מוצגת כאן כהוכחה עקרונית בין האפשרויות החלופיות הרבות.
בעוד שהתקני PDMS, המיוצרים על ידי תבנית 2PP, יכולים להיות מחוברים לפני השטח של מצעי תרבית תאים נפוצים, כגון כיסויי זכוכית או צלחות פטרי, בעבודה זו נעשה שימוש במערכי מיקרואלקטרודות משולבים במצע מסחרי. לא נעשה כל מאמץ לייעל את התכנון התלת-ממדי למערך המיקרואלקטרודות, והצימוד המכני בוצע תחת הנחיית סטריאומיקרוסקופיה שמטרתה הייתה רק למקם את המכשיר על פני המערך, תוך השארת חלק מהמיקרואלקטרודות חשופות בשני הצדדים, המקור והמטרה. זה מאפשר הערכה ראשונית של ההשלכות התפקודיות של הקישוריות המוגבלת בתרביות תאים עצביים.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות היותו בן עשרות שנים, היישום של טכנולוגיית 2PP בדפוס העתק מבוסס PDMS בקנה מידה מיקרומטרי הוא פיתוח לאחרונה43,44. בהקשר זה, סדרה של נקודות נדונות להלן כדי לסייע למשתמשים לשחזר ביעילות עבודה זו.
עבור עיצוב מודל תלת ממדי, ודא כי המודל אינו כולל חורים או הצטלבויות עצמיות. הענק הרשאה לתבנית הקובץ הבינארית בשעת שמירה כ- STL, עבור טביעת הרגל הקטנה יותר של גודל הקובץ מאשר בקידוד ASCII. זה מועיל במיוחד עבור עיצובים עם גיאומטריות מורכבות עבור אובייקטים ברוחב מיליליטר. שימוש בקבצי STL בינאריים מרמז גם על עומס CPU נמוך, בהמשך התהליך הכנת החלק המכני להדפסה תלת-ממדית. הממדים הפיזיים של התכונות בתוך קובץ STL מיוצגים ביחידות חסרות ממד. במהלך עיבוד קובץ STL, יחידות מפורשות כמיקרומטרים. לכן, מומלץ לאמץ מראש את יחידת העניין, כלומר מיקרומטר, בעת הכנת הקובץ. הדיוק של המודל המודפס נקבע על ידי מספר המשטחים הקרובים למשולשים. עבור מספר לא מספיק של משטחים, חספוס פני השטח הרצוי יתפתח. עם זאת, שאיפה לדיוק גבוה מדי על ידי מספר גדול מאוד של משטחים באה במחיר של עומס חישובי גבוה, מה שגורם לעיבוד הקובץ להיות איטי.
עבור הדפסה תלת מימדית, במהלך ההדפסה, האובייקט הפיזי התלת-ממדי נוצר באמצעות סריקת גלבו מהירה במישור x-y ותנועת piezo בכיוון z. פעולה זו ממקדת את קרן הלייזר הפמטו-שנייה בתוך כל ווקסל תלת-ממדי נתון. עם זאת, כאשר מבני ההדפסה גדולים יותר מטווחי הכיסוי המרחבי של הגאלבו והפיזו, יש לפצל את האובייקט באופן פרוגרמטי לגושים. בעוד שזו דרישה לחלקים מודפסים בגודל מילימטרי, צמתים בין בלוקים קשורים לקווי תפירה (לא מושלמים). אופטימיזציה זהירה של ספירת בלוקים ומיקום קווי תפירה בכיווני x, y ו- z חיוניים כדי למנוע הפרעה לתכונות גיאומטריות קריטיות של האובייקט הסופי עם קווי תפירה. בועות עלולות להיווצר בממשק ההדפסה מסיבות שונות (למשל, מצע הזיהומים וחוסר ההומוגניות של photoresist), ולהשפיע לרעה על איכות ושלמות המבנה המודפס. יתר על כן, כוח לייזר גבוה יותר יכול להוביל לעלייה בהתרחשותם. הפחתת עוצמת הלייזר, בשכבה הנמוכה ביותר של החלק המודפס, תמזער את הסיכויים להיווצרות בועות. כחלופה להדפסת החלק כולו כמבנה מוצק, ניתן לשקול שיטת מעטפת ופיגום. זה כרוך להדפיס רק את פני השטח החיצוניים של החלק (פגז), כמו גם אלמנטים מנסרה משולש בתוכו. אלמנטים אלה מופרדים על ידי שכבות אופקיות (פיגומים), המחזיקים את השרף הלא פולימרי בכיסים קטנים. שיטה זו מקצרת משמעותית את זמן ההדפסה, רלוונטי במיוחד עבור מבנים בגודל מילימטרי. עם זאת, מכיוון שנשאר שרף לא פולימרי, חשיפה לקרינת UV לאחר ההדפסה הכרחית כדי להבטיח יציבות מכנית מלאה, אם כי שלב זה חייב להתבצע בעדינות כדי למנוע עיוות של החלק המודפס. הזמן שלאחר הריפוי תלוי בשרף הנבחר, בעובי החלק ובעוצמת UV40. לקבלת תוצאות מיטביות, מומלץ לבצע ניסוי ראשוני כדי להעריך את הזמן הדרוש לריפוי מעמיק מלא, באמצעות טיפת photoresist והערכת חתך חתך שלה, לאחר חשיפה UV. תקופת הריפוי הרגילה נעה בין 5 ל -20 דקות.
עבור תבניות העתק PDMS, ייצור נקי של התקן PDMS עם תכונות בקנה מידה מיקרומטרי, ללא מתקני חדר נקי, יכול להיות מאתגר: מיקרו-חלקיקים הנישאים באוויר יכולים לשכון על פני השטח הדביקים מאוד של PDMS ולעכב את האטימה בין המכשיר למצע, או לחסום את החלק של מיקרו-ערוצים בודדים. ביצוע שלבי הפרוטוקול מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית ומיגון עקבי של משטח PDMS עם איזופרופנול ממזער באופן משמעותי את סיכוני הזיהום. טמפרטורת הריפוי ומשכה משפיעים ישירות על קישור צולב PDMS ועל התכונות הפיזיקליות הנובעות מכך. בפרט, הדבקה של PDMS נרפא הוא גורם קריטי. מצד אחד, נדרש אטימה הדוקה בין מכשיר PDMS, לבין המשטח המשמש לתרבית תאים עצביים (למשל, כיסוי זכוכית או MEA), כדי להגביל ביעילות את המעבר של הנוירוטים. מצד שני, מכשיר ה-PDMS צריך להיצמד למשטח באופן הפיך, כך ששכבת הבידוד העדינה לא תיפגע לאחר הסרת המכשיר. בעוד התכווצות PDMS במהלך הריפוי מתרחשת וניתן לתקן אותה על ידי שינוי קנה מידה מראש של התבנית, עבור טמפרטורות ומרווחי ריפוי המצוינים כאן התכווצות תהיה קטנה מ -2% 42 ולא תשפיע באופן משמעותי, מכשירי PDMS חד שכבתיים. בסך הכל, עקוב במדויק אחר ערכי טמפרטורת הריפוי ומשך הזמן המומלצים, לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
סקירה כללית של יתרונות ומגבלות השיטה
טכניקה המבוססת על כתיבת לייזר ישירה של 2 פוטונים מוצעת לייצור מהיר של התקנים פולימריים בקנה מידה מיקרו למחקר ניסיוני של רשתות עצביות מודולריות. בניגוד לפוטוליתוגרפיה רכה, הגישה המוצעת אינה דורשת רמה גבוהה של מומחיות טכנית, בתנאי שמערך הדפסה תלת-ממדית 2PP פונקציונלי נגיש ותפעולי. למרבה הפלא, השיטה מאפשרת מעבר ממודל תלת ממדי שתוכנן על ידי CAD למכשיר PDMS פונקציונלי תוך יום אחד, ובכך מספקת נתיב ישיר ויעיל מרעיון למימוש מוחשי. באופן ספציפי, בחירה במצב הדפסת פגז ופיגומים מפחיתה באופן משמעותי את הזמן הדרוש ליצירת התבנית, מכיוון שרק חלק קטן מהנפח שלה מודפס. ריפוי UV לאחר מכן של הרכיב המודפס מבטיח את יציבותו המכנית ואת חוסנו, כפי שאומת כאן מעל 50 מחזורי יציקה עם PDMS.
בהשוואה לשיטות מסורתיות, הדפסת תלת מימד 2PP מתגאה ביתרון ברור, הבולט ביותר כשמדובר בייצור תבניות עם יחס גובה-רוחב משמעותי, דרישות רזולוציה תובעניות וגיאומטריות תלת מימדיות מורכבות. הייצור של תבניות אב באמצעות ליתוגרפיית UV סטנדרטית מוגבל על ידי עובי התנגדות של כ 200 מיקרומטר. רצפים מורכבים של מחזורי ציפוי וחשיפה35, LIGA (ליתוגרפיה, ציפוי אלקטרוליטי ויציקה) יקרים או תהליכי תחריט יונים תגובתי עמוק (DRIE)36 נדרשים כדי להשיג יחסי גובה וגובה-רוחב גדולים יותר. בניגוד חד, כפי שהודגם בעבודה החלוצית של קומי ואחרים בשנת 201037, טכניקת 2PP מציעה טווח בלתי מוגבל למעשה ליחס הממדים של החלקים המודפסים, המשתרע מתת-מיקרומטר ועד מילימטרים. כאן הודגם תהליך מיקרו-ייצור של תבנית עם הפרש משמעותי בגובה חלקיה, הכולל הבחנה של יותר מפי 100 בין גובה המיקרו-ערוצים (5 מיקרומטר לגובה המרבי של העובש (545 מיקרומטר; ראה איור 2).
כמו כן, ניתן להשיג בקלות רזולוציה תת-מיקרומטרית על ידי ביצוע מפרטי הפרוטוקול המתוארים. לשם השוואה, השגת רזולוציות עובש משופרות באמצעות פוטוליתוגרפיה UV דורשת השקעת הון. המסכות בעלות הרזולוציה הטובה ביותר, המשתמשות בתצהיר כרום על קוורץ ברזולוציה נומינלית של 600 ננומטר, מתומחרות בכמה סדרי גודל גבוה יותר ממסכות השקיפות העילית המודפסות בלייזר, בעלות רזולוציה של 250 מיקרומטר35, אולם ראו את עבודתם של Pirlo et al.41. כדי להיות בת קיימא לשימוש פנימי, השיטה שנבחרה חייבת להיות חסכונית. עבור מעבדות ביולוגיות רבות, ההוצאה הכוללת הקשורה לפוטוליתוגרפיה רכה קונבנציונלית או כתיבה ישירה בלייזר מהווה מכשול. אמנם ניתן להפוך את שתי הטכנולוגיות לנגישות יותר על ידי רכישה והרכבה של הרכיבים החיוניים, אך גישה זו דורשת מומחיות נוספת ועדיין דורשת השקעה ניכרת. בהקשר זה, נקודה חיונית שיש לקחת בחשבון היא הספקטרום הרחב יותר של יישומים הניתנים להשגה באמצעות כתיבה ישירה בלייזר. שלא כמו פוטוליתוגרפיה רכה קונבנציונלית, המוגבלת בעיקר לייצור מיקרו-עובש, הדפסת תלת-ממד 2PP מפגינה רב-תכליתיות יוצאת דופן. היישומים הפוטנציאליים שלה משתרעים ממיקרופלואידיקה ומיקרו-אופטיקה ועד פוטוניקה ומיקרומכניקה משולבות. זה הופך את ההשקעה בטכנולוגיה זו למושכת כמתקן משותף לתחומים מדעיים מרובים ומגוונים. לדוגמה, המתודולוגיה מבוססת 2PP שפותחה בפרוטוקול זה היא תוצאה של שיתוף פעולה בין-תחומי בין מחלקות מדעי המוח והמתמטיקה בתוך המוסד שלנו. בנוסף, פיתוח photoresist הוא תחום מחקר פעיל, והוא עשוי להרחיב את מגוון היישומים של הדפסה תלת-ממדית 2PP. מקרה לדוגמה הוא ההקדמה האחרונה של שרף IP-PDMS. על ידי פילמור למבנים בעלי תכונות כמו PDMS38, שרף זה פותח את הפוטנציאל למיקרו-ייצור ישיר של רכיבים בעלי תאימות ביולוגית בעלי משטח מפותל או מכילים חללים חלולים. מורכבויות אלה עומדות כמחסומים להשגת תוצאות דומות באמצעות הליכי דפוס העתק קונבנציונליים.
כהדגמה של שיטה זו, הובאו ראיות המצביעות על התפתחות קישוריות חד-כיוונית בין שני מודולים ברשת עצבית מודולרית. התבנית בקנה מידה מיקרו, המיוצרת בטכניקת 2PP, הייתה בעלת סיבולת מספקת כדי לעבור יציקות PDMS מרובות, ויש לה את הדיוק הנדרש בקנה מידה מיקרו. לסיכום, היקף היישום של הפרוטוקול המתואר בעבודה זו משתרע מעבר למקרה המתואר. ככל שהגישה לטכנולוגיית ההדפסה 2PP הופכת נפוצה יותר ויותר, ההשקעה הראשונית הנדרשת ליישומה תקטן בעוד מגוון היישומים הפוטנציאליים שלה יתרחב.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מ.ג. מכירה בתמיכה כספית מתוכנית המסגרת H2020 של האיחוד האירופי באמצעות מועצת החדשנות האירופית (פרויקט IN-FET, GA n. 862882, פרויקט Arbor-IO, FLAG-ERA ופרויקט המוח האנושי, ID 650003) ומ- SISSA (אזור מדעי המוח). G.N. מודה בתמיכה כספית ממשרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (MUR) באמצעות המענק Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (אזור מתמטיקה). אנו מודים ל- M. Gigante, B. Pastore ו- M. Grandolfo על עזרתם בהדפסה תלת-ממדית, תרבית תאים והדמיה חיה, כמו גם לד”ר P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente ו- H.C. Schultheiss על הדיונים. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
| BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
|
| CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-AP5 | Tocris | #0106 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
| Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
| in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
| Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
| NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
| Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
| Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |
参考文献
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13 (2011).
- Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
- Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
- DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32 (2016).
- Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010 (2012).
- Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044 (2020).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400 (2014).
- Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157 (2016).
- Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
- Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424 (2016).
- Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
- Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031 (2011).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington’s disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
- Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
- Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
- Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
- Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625 (2017).
- le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412 (2015).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie – International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276 (2017).
- Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307 (2019).
- Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
- Baldacchini, T. . Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , (2015).
- Madou, M. J. . Fundamentals of Microfabrication. , (2018).
- Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056 (2010).
- Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26 (2014).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701 (2016).
- Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49 (2017).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
- Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
- Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
- Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
- Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408 (2011).
- Madsen, M. H., Feidenhans’l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002 (2014).
- Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
- Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).
