ポリカーボネート超遠心チューブを洗浄および再利用して、プロテオミクス実験に適した細胞外小胞分離を行うための詳細なプロトコルが提供されています。
使い捨ての実験用プラスチックは、汚染の危機を悪化させ、消耗品のコストの一因となります。細胞外小胞(EV)の単離では、ポリカーボネート製の超遠心分離機(UC)チューブを使用して、関連する高い遠心力に耐えます。EVプロテオミクスは進歩的な分野であり、これらのチューブの検証済みの再利用プロトコルが不足しています。低収率のタンパク質単離プロトコルやダウンストリームプロテオミクスに消耗品を再利用するには、遠心チューブ由来の合成ポリマー汚染がなく、残留タンパク質を十分に除去するなど、質量分析法による取得と試薬の適合性が必要です。
このプロトコルは、EVプロテオミクス実験で再利用するためにポリカーボネートUCチューブを洗浄する方法を記述し、検証します。洗浄プロセスでは、タンパク質の乾燥を防ぐためにUCチューブをH2Oに直ちに浸し、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤で洗浄し、熱い水道水、脱塩水、および70%エタノールですすいでください。下流のEVプロテオミクスに対するUCチューブの再利用プロトコルを検証するために、UCと密度勾配分離の差を用いて心血管組織からEVを単離する実験を行った後、使用済みのチューブを入手しました。チューブを洗浄し、実験プロセスをEVサンプルなしで繰り返し、未使用のブランクUCチューブと洗浄されたUCチューブを比較しました。単離手順から得られた疑似EVペレットを溶解し、少量のタンパク質サンプル用に修正した市販のタンパク質サンプル調製キットを使用して、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析用に調製しました。
洗浄後、疑似ペレットで同定されたタンパク質の数は、同じチューブからの以前のEV分離サンプルと比較して98%減少しました。洗浄したチューブとブランクチューブを比較したところ、両方のサンプルにごく少数のタンパク質(≤20)が含まれ、86%の類似性がありました。洗浄したチューブのクロマトグラムにポリマーのピークがないことを確認しました。最終的には、EVの濃縮に適したUCチューブ洗浄プロトコルの検証により、EVラボで発生する廃棄物が削減され、実験コストが削減されます。
細胞外小胞(EV)は、タンパク質などの生物学的に活性な貨物を運ぶ細胞から放出される脂質二重層で区切られた粒子であり、細胞間コミュニケーションや生物学的石灰化の形成など、さまざまな生物学的プロセスに関与しています1。これらの粒子はすべての体液や組織に見られ、その生物学的活性と用途は急速に進化している科学研究分野です。これらのナノ粒子の単離と検証は、サイズが小さく、リポソームやタンパク質凝集体などの他の粒子との生物学的類似性のために、さまざまな課題を提示します。最新の国際細胞外小胞学会のガイドラインである Minimal information for studies of cellular sifles 2018 (MISEV2018) は、EV 科学研究の基準として認められています2.
EVの絶縁には、アップストリームのソースとダウンストリームのアプリケーションに応じて、さまざまな方法を併用する必要があります。2015年現在、EVの最も一般的な一次分離方法は示差超遠心分離(UC)2でした。原理的には、最初の低速遠心分離では、細胞や細胞の破片など、より大きく、より密度の高い不要な成分が分離され、EVは上清に残ります。その後、UCは非常に高い遠心力を使用してEVをペレット化し、より小さいまたは密度が低いが、高密度の非EV粒子を含む可能性のある他の粒子からEVを分離して精製します。ほとんどのプロトコルでは、多くの場合、何らかのステップでUCを使用して、EVを流体から分離します3。さらに、UCは、OptiprepTM ヨージキサノールなどの媒体と遠心力を使用して浮力密度4に従ってEVを分離する密度勾配超遠心分離(DGUC)など、EV分離の他の方法で使用されます。EV絶縁の方法は他にも存在します3。
EVが決定する生物学的プロセスと、バイオマーカーおよび病態生理学に関する情報としての可能性の理解が急速に進化していることを考えると、プロテオミクスなどの発見ベースの分析が勢いを増しています5,6,7,8。EVは小さく、供給源によっては、全組織または細胞溶解物と比較してタンパク質の収量が低くなります(<1μg)。プロテオミクス分析のためのEVの単離には、上流の液体または組織からの非EVタンパク質汚染物質の除去、単離プロセス中のEVタンパク質分解の考慮、ペプチド調製および質量分析と化学的に適合性のあるタンパク質溶液を生成する方法の利用など、特別な考慮事項が必要です。
研究室の消耗品は、多くの場合、プラスチックで使い捨てです。これらの使い捨て材料は、世界的なプラスチック汚染の危機と消耗品のコストの一因となっています。特殊なポリカーボネートおよびポリスチレンUCチューブは、実験室用途でEVをペレット化するために必要な高い遠心力に耐えるように設計されています。UCチューブを滅菌・消毒して再利用することは可能ですが、プロテオミクス解析、特にEVなどのタンパク質収量の低いプロテオミクス解析には特別な注意が必要です。以前の使用から残留タンパク質を十分に除去することが最優先事項であるだけでなく、質量分析法およびプラスチック由来のポリマー汚染との化学的適合性も考慮する必要があります。
ここでは、質量分析に適した界面活性剤を使用したポリカーボネートチューブの洗浄プロトコルを提示し、検出限界以下の残留タンパク質の除去に成功し、検出可能なポリマー汚染物質がないことを検証するための実験を行います。UCとDGUCの両方の目的を使用してEVプロテオミクスアプリケーションの洗浄プロトコルを検証するために、UCとDGUCを組み合わせたプロトコルを使用して、ヒト血管系組織EVの分離からチューブを取得しました。チューブは、記載されたプロトコルを用いて洗浄され、実験プロセスは、未使用のブランクUCチューブと洗浄されたUCチューブを比較するサンプルなしで繰り返された。最終的には、EVの濃縮に適したUCチューブ洗浄プロトコルの検証により、EVラボで発生する廃棄物が削減され、そのような実験に関連するコストが削減されます。
ここでは、EV濃縮およびプロテオミクスアプリケーション用のポリカーボネートUCチューブを洗浄するためのプロトコルについて説明し、検証します。この質量分析取得プロトコルの検出限界を下回る洗浄された疑似ペレット分析と比較して、以前のUCチューブサンプルからの残留タンパク質の除去に成功したことを実証し、洗浄されたUCチューブ疑似ペレットと比較して、ブランクの未使用UC…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01HL147095、R01HL141917、R01HL136431、興和株式会社、およびMarie Skłodowska-Curie助成金契約第101023041号(R.Cahalane)に基づく欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムからの研究助成金によって支援されました。 図 1 は Biorender.com を使用して作成されました。現在の洗浄プロトコルは、国際細胞外小胞学会 2023 Education Day (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) で発表された推奨チューブ洗浄プロトコルを変更して開発されました。頸動脈組織のEVサンプルを提供してくれたUniversity Health Network(カナダ、トロント大学)のKathryn Howe博士とSneha Raju博士に感謝します。
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
MilliQ water | water | ||
PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |