概要

細胞外小胞のプロテオミクス分析におけるポリカーボネート超遠心チューブの再利用

Published: March 08, 2024
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概要

ポリカーボネート超遠心チューブを洗浄および再利用して、プロテオミクス実験に適した細胞外小胞分離を行うための詳細なプロトコルが提供されています。

Abstract

使い捨ての実験用プラスチックは、汚染の危機を悪化させ、消耗品のコストの一因となります。細胞外小胞(EV)の単離では、ポリカーボネート製の超遠心分離機(UC)チューブを使用して、関連する高い遠心力に耐えます。EVプロテオミクスは進歩的な分野であり、これらのチューブの検証済みの再利用プロトコルが不足しています。低収率のタンパク質単離プロトコルやダウンストリームプロテオミクスに消耗品を再利用するには、遠心チューブ由来の合成ポリマー汚染がなく、残留タンパク質を十分に除去するなど、質量分析法による取得と試薬の適合性が必要です。

このプロトコルは、EVプロテオミクス実験で再利用するためにポリカーボネートUCチューブを洗浄する方法を記述し、検証します。洗浄プロセスでは、タンパク質の乾燥を防ぐためにUCチューブをH2Oに直ちに浸し、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)洗剤で洗浄し、熱い水道水、脱塩水、および70%エタノールですすいでください。下流のEVプロテオミクスに対するUCチューブの再利用プロトコルを検証するために、UCと密度勾配分離の差を用いて心血管組織からEVを単離する実験を行った後、使用済みのチューブを入手しました。チューブを洗浄し、実験プロセスをEVサンプルなしで繰り返し、未使用のブランクUCチューブと洗浄されたUCチューブを比較しました。単離手順から得られた疑似EVペレットを溶解し、少量のタンパク質サンプル用に修正した市販のタンパク質サンプル調製キットを使用して、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析用に調製しました。

洗浄後、疑似ペレットで同定されたタンパク質の数は、同じチューブからの以前のEV分離サンプルと比較して98%減少しました。洗浄したチューブとブランクチューブを比較したところ、両方のサンプルにごく少数のタンパク質(≤20)が含まれ、86%の類似性がありました。洗浄したチューブのクロマトグラムにポリマーのピークがないことを確認しました。最終的には、EVの濃縮に適したUCチューブ洗浄プロトコルの検証により、EVラボで発生する廃棄物が削減され、実験コストが削減されます。

Introduction

細胞外小胞(EV)は、タンパク質などの生物学的に活性な貨物を運ぶ細胞から放出される脂質二重層で区切られた粒子であり、細胞間コミュニケーションや生物学的石灰化の形成など、さまざまな生物学的プロセスに関与しています1。これらの粒子はすべての体液や組織に見られ、その生物学的活性と用途は急速に進化している科学研究分野です。これらのナノ粒子の単離と検証は、サイズが小さく、リポソームやタンパク質凝集体などの他の粒子との生物学的類似性のために、さまざまな課題を提示します。最新の国際細胞外小胞学会のガイドラインである Minimal information for studies of cellular sifles 2018 (MISEV2018) は、EV 科学研究の基準として認められています2.

EVの絶縁には、アップストリームのソースとダウンストリームのアプリケーションに応じて、さまざまな方法を併用する必要があります。2015年現在、EVの最も一般的な一次分離方法は示差超遠心分離(UC)2でした。原理的には、最初の低速遠心分離では、細胞や細胞の破片など、より大きく、より密度の高い不要な成分が分離され、EVは上清に残ります。その後、UCは非常に高い遠心力を使用してEVをペレット化し、より小さいまたは密度が低いが、高密度の非EV粒子を含む可能性のある他の粒子からEVを分離して精製します。ほとんどのプロトコルでは、多くの場合、何らかのステップでUCを使用して、EVを流体から分離します3。さらに、UCは、OptiprepTM ヨージキサノールなどの媒体と遠心力を使用して浮力密度4に従ってEVを分離する密度勾配超遠心分離(DGUC)など、EV分離の他の方法で使用されます。EV絶縁の方法は他にも存在します3

EVが決定する生物学的プロセスと、バイオマーカーおよび病態生理学に関する情報としての可能性の理解が急速に進化していることを考えると、プロテオミクスなどの発見ベースの分析が勢いを増しています5,6,7,8。EVは小さく、供給源によっては、全組織または細胞溶解物と比較してタンパク質の収量が低くなります(<1μg)。プロテオミクス分析のためのEVの単離には、上流の液体または組織からの非EVタンパク質汚染物質の除去、単離プロセス中のEVタンパク質分解の考慮、ペプチド調製および質量分析と化学的に適合性のあるタンパク質溶液を生成する方法の利用など、特別な考慮事項が必要です。

研究室の消耗品は、多くの場合、プラスチックで使い捨てです。これらの使い捨て材料は、世界的なプラスチック汚染の危機と消耗品のコストの一因となっています。特殊なポリカーボネートおよびポリスチレンUCチューブは、実験室用途でEVをペレット化するために必要な高い遠心力に耐えるように設計されています。UCチューブを滅菌・消毒して再利用することは可能ですが、プロテオミクス解析、特にEVなどのタンパク質収量の低いプロテオミクス解析には特別な注意が必要です。以前の使用から残留タンパク質を十分に除去することが最優先事項であるだけでなく、質量分析法およびプラスチック由来のポリマー汚染との化学的適合性も考慮する必要があります。

ここでは、質量分析に適した界面活性剤を使用したポリカーボネートチューブの洗浄プロトコルを提示し、検出限界以下の残留タンパク質の除去に成功し、検出可能なポリマー汚染物質がないことを検証するための実験を行います。UCとDGUCの両方の目的を使用してEVプロテオミクスアプリケーションの洗浄プロトコルを検証するために、UCとDGUCを組み合わせたプロトコルを使用して、ヒト血管系組織EVの分離からチューブを取得しました。チューブは、記載されたプロトコルを用いて洗浄され、実験プロセスは、未使用のブランクUCチューブと洗浄されたUCチューブを比較するサンプルなしで繰り返された。最終的には、EVの濃縮に適したUCチューブ洗浄プロトコルの検証により、EVラボで発生する廃棄物が削減され、そのような実験に関連するコストが削減されます。

Protocol

1.チューブのクリーニング 注:EVの分離手順では、キャップ付きとキャップなしの両方のポリカーボネートUCチューブを使用します(詳細は以下を参照)。キャップ付きチューブとキャップなしチューブの両方で同じ手順に従いました。キャップ付きチューブの場合、蓋の部品は個別に洗浄され、乾燥および事前保管後に再組み立てされました。 ポリカーボネートチューブを最初に使用し、サンプルを取り除いた後、すぐにUCチューブを水道水に浸して、サンプルがチューブの側面に乾燥しないようにします。 チューブを0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に移し、水道水に10分間浸します。 一度に1本のチューブで、チューブからSDS溶液のほとんど(すべてではない)をデカントし、綿棒を使用してEVペレットが配置されていたチューブの領域を完全に拭きます。注意: 毛のあるものは使用しないでください。このプロトコルでは、通常の綿棒を使用しました。ただし、チューブの洗浄には、特殊な糸くずの少ない綿棒を使用できます。 熱い水道水(~50°C)で少なくとも3回すすいでください。チューブを完全に充填してデカントしてください。 スプレーボトルまたは狭口洗浄ボトルを使用して、脱塩水で1回すすぎます。 スプレーボトルを使用して、70%エタノールで1回すすぎます。 チューブを逆さまにして乾かします。注:蛍光活性化細胞選別用のチューブラックは、UCチューブの乾燥に適しています。 完全に乾いたチューブをきれいな瓶に入れます。それらは再利用の準備ができています。注:現在、このプロトコルは最大2倍の再利用が検証されています。 2. EVエンリッチメント 注:以下のEV単離およびプロテオミクスプロトコルは、元の組織EV単離、ならびにブランク(未使用)および洗浄されたチューブサンプルを得るために使用された「模擬サンプル」の両方に使用された。元のサンプルは、頸動脈内膜摘出術を受けた患者の頸動脈プラークから組織に閉じ込められたEVを再懸濁したものです。手術標本は、University Health Network(カナダ、トロント)から収集され、施設倫理委員会によって承認されました。すべての患者は、ヘルシンキ宣言に従って、サンプル収集とデータ分析についてインフォームドコンセントを提供しました。模擬サンプルは、真空チューブと洗浄チューブをEV分離サンプルと同じ溶液と処理手順で処理して得られた擬似ペレットでした。 EV サンプルまたは模擬サンプルを PBS on ice で解凍します。 NTE緩衝液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0.137 M NaCl pH 7.4)と滅菌フィルターを作製します。 サンプルを10,000 × g で4°Cで10分間遠心します。 上清を1mLのオープントップポリカーボネートチューブに移します。 上清を100,000×g で4°Cで1時間遠心分離します。 ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含む滅菌ろ過NTEバッファー150 μLに再懸濁します。 1.5 mLの微量遠心チューブに移し、NTEバッファーを添加して、総サンプル量が1.5 mLになるようにします。 サンプルを氷の上に置いてください。 3. 密度勾配の作製と密度勾配分離 注:このEVアイソレーションプロトコルは、Blaserらによって 以前に説明されています9。 ヨウ素密度勾配培地の5つの溶液(10%、15%、20%、25%、30%)を調製し、NTEバッファーを希釈剤として使用します。 5つの密度溶液を、下部に30%、上部に10%のキャップ付き超遠心チューブに順番に層状にします。 チューブのキャップを固定し、室温で1時間、安定した水平位置にゆっくりと移動します。 1時間後、チューブを氷上で30分間ゆっくりと垂直位置に移動し、勾配を冷却します。 調製した密度勾配チューブの上部に、サンプルまたは模擬サンプル(NTEバッファー)1.5 mLを加えます。 超遠心チューブを250,000 × g で40分間、4°Cで。 密度勾配(2.4 mL)の上部画分をキャップなしの超遠心チューブに除去します。滅菌ろ過したNTEバッファーで9mLまで充填します。 EVを100,000 × g で4°Cで1時間超遠心分離してペレット化します。注意: 目に見えるEVペレットの位置または予想される位置をマーカーで丸で囲みます。これにより、綿棒で直接ペレットの領域をきれいにすることができます。 チューブを逆さまの位置に3分間移動させながら、上清を吸引します。チューブの右側を上に向ける前に、綿棒で残りの液滴を取り除きます。 EVペレットを、参照キット内の12 μLの溶解バッファーに再懸濁します。 4. プロテオミクスのためのペプチド調製 注:プロテオミクスサンプル調製は、キットプロトコルに従って行い、低存在量のタンパク質サンプルを社内で修正しました。変更されたプロトコルは次のとおりです。 サンプルを溶解、変性、還元、アルキル化するには、溶解バッファー中で95°Cで10分間加熱します。 Lys-C/トリプシン消化液を用いて、サンプル中の溶解液10 μLと消化液10 μLを用いて、37°Cで2時間サンプルを分解します。 キット溶液を使用して、親水性および疎水性の汚染物質を洗い流し、精製されたペプチドから溶出することにより、カートリッジを介してペプチドを精製します。 精製したペプチドを45°Cの高速真空で45分間、または乾くまで乾燥させます。注:ペプチドの過乾燥は避けてください。 サンプルは、質量分析シーケンシングの時まで-80°Cで保存してください。 乾燥ペプチドに17 μLのLC負荷溶液を加えます。 サンプルを氷の上に1時間放置します。 サンプルを短時間ボルテックスし、次いで超音波水浴中で5分間超音波処理する。 LC負荷サンプルを16,000 × g で1分間遠心分離し、上から15 μLを吸引し、新しいチューブに分離します。 5. 液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析シーケンシング 2 μLのLCロードペプチド溶液を質量分析計に注入します。 デュアルカラムセットアップを使用してペプチドを分画します。 カラムを45°Cの一定温度で加熱します。 分析グラジエントを300 nL/minで5%から21%溶媒B(アセトニトリル/ 0.1%ギ酸)で60分間実行し、続いて21%から30%の溶媒Bを10分間実行し、さらに10分間95%〜5%ジグソー洗浄します。 MS1 の分離度を 120 K(最大注入時間、25 ms)に設定し、上位のプリカーサーイオン(サイクルタイム 3.0 秒以内)を HCD 分離幅 1.2 m/z に、動的排除が有効(60 秒)に設定し、MS2 の分離度を 60 K(最大注入時間、自動、正規化コリジョンエネルギー、24%、26%、28%)に設定します。 MS1とMS2の捕捉範囲をそれぞれ400 m/z-1,200 m/zと120 m/z-1,200 m/zに設定します。 6. ペプチド/タンパク質の同定 取得したペプチドスペクトルを、市販の検索アルゴリズムを用いてプロテオミクス検索ソフトウェアでヒトuniProtデータベースに対して検索します。 消化酵素をトリプシンに設定し、最大2つの切断を逃します。 プリカーサートレランスを10ppmに、フラグメントトレランスウィンドウを0.02Daに設定します。 メチオニン酸化とN末端アセチル化を可変修飾として設定し、システインカルバミドメチル化を固定修飾として設定します。 Percolator アルゴリズムによって計算された 1.0% の偽発見率(FDR)しきい値に基づいてペプチドをろ過します。 特定のタンパク質群に割り当てられ、他のタンパク質群では検出されないペプチドのみを一意と見なし、さらなる分析に使用します。 分析には、各タンパク質に少なくとも 2 つの固有のペプチドのみを含めます。 プリカーサーイオン検出でIDを最大化します。 最大保持時間シフトが 10 分、質量許容誤差が 10 ppm、シグナル対ノイズ比が最小 5 のクロマトグラフィーアライメントを実行します。 ペプチド存在量を総ペプチド量で正規化します。

Representative Results

洗浄プロトコル(図1)を検証するために、2つの実験を行いました。まず、洗浄したチューブからの「模擬サンプル」のプロテオームを、チューブの最初の使用による組織EVサンプルのプロテオームと比較して、同定されたタンパク質のキャリーオーバーを決定しました。代表的なクロマトグラムは、チューブの洗浄後にピークの不均一性が低下していることを示していま?…

Discussion

ここでは、EV濃縮およびプロテオミクスアプリケーション用のポリカーボネートUCチューブを洗浄するためのプロトコルについて説明し、検証します。この質量分析取得プロトコルの検出限界を下回る洗浄された疑似ペレット分析と比較して、以前のUCチューブサンプルからの残留タンパク質の除去に成功したことを実証し、洗浄されたUCチューブ疑似ペレットと比較して、ブランクの未使用UC…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01HL147095、R01HL141917、R01HL136431、興和株式会社、およびMarie Skłodowska-Curie助成金契約第101023041号(R.Cahalane)に基づく欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムからの研究助成金によって支援されました。 図 1 は Biorender.com を使用して作成されました。現在の洗浄プロトコルは、国際細胞外小胞学会 2023 Education Day (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) で発表された推奨チューブ洗浄プロトコルを変更して開発されました。頸動脈組織のEVサンプルを提供してくれたUniversity Health Network(カナダ、トロント大学)のKathryn Howe博士とSneha Raju博士に感謝します。

Materials

10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube Beckman Coulter Life Sciences 355630 uncapped ultracentrifuge tube(s) 
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter Life Sciences 355603 capped ultracentrifuge tube(s) 
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm ThermoFisher Scientific 164946 and ES902 Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head VWR 89031-270 cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.   ThermoFisher Scientific BRE725533 Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) NA NA Human database
MilliQ water water
PreOmics iST kit   PreOmics P.O.00027 commercial protein sample preparation kit 
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5) ThermoFisher Scientific NA Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm  NA NA Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%) Boston BioProducts BM-230 detergent

参考文献

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記事を引用
Cahalane, R. M. E., Turner, M. E., Clift, C. L., Blaser, M. C., Bogut, G., Levy, S., Kasai, T., Driedonks, T. A. P., Nolte-‘t Hoen, E. N. M., Aikawa, M., Singh, S. A., Aikawa, E. Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (205), e66126, doi:10.3791/66126 (2024).

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