概要

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

Published: January 12, 2024
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概要

ここでは、 シロイヌナズ ナの苗木の脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成モニタリング用に設計された高度なツールについて説明します。この新しい方法論は、高い空間分解能と時間分解能で非侵襲的なリアルタイムクロロフィル蛍光イメージングを提供します。

Abstract

クロロフィルの生合成は、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階の1つである脱エチオール化の特徴です。クロロフィル生合成の厳密に制御された非常にダイナミックなプロセスは、顕花植物の暗闇から光への移行中に引き起こされます。エチオレートされた苗木が日光の最初の痕跡にさらされた瞬間に、プロトクロロフィリドからクロロフィリドへの急速な(秒順の)変換は、ユニークな光受容タンパク質複合体によって媒介され、その後の代謝ステップを介して完全に機能するクロロフィルの生産につながります。クロロフィル含有量分析の標準的な手法には、剥離した植物組織からの色素抽出が含まれますが、このような高速プロセスの研究には適用されません。光誘起脱エチオレーション後の最初の数時間で、 生体内の クロロフィル動態を高精度かつ時空間分解能で調査するために、装置とプロトコルが開発されました。ここでは、 シロイヌナズ ナの脱エチオレーションの初期段階におけるクロロフィルの統計的に頑健な定量のために設計された詳細な手順を紹介します。

Introduction

脱エチオレーションは、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階であり、多くの形態学的変化と植物代謝の完全な再編成(ヘテロから自己熱帯へ)を特徴としています1。クロロフィルの生合成は、植物における光による脱エチオール化の特徴であり、非常にダイナミックなプロセスです。暗色で産生された前駆体プロトクロロフィリドからのクロロフィルの形成は、反応性副生成物による損傷を避けるために緊密に調整する必要があります2。プロトクロロフィリドのクロロフィリドへの還元は、光によって直接活性化されるユニークな酵素である光依存性プロトクロロフィリド酸化還元酵素(POR)によって触媒されます。反応は非常に速く、msからs 3のオーダーで起こり、苗の照射後数分以内に認識可能なクロロフィルの蓄積をもたらす4,5,6。葉緑体生合成が完全に機能する光合成装置を確立するには、より多くの時間(数時間から数日)が必要である3。

クロロフィル含有量の分析には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や分光光度法など、さまざまな方法があります。通常、これらの技術は植物組織の破壊を要求し4,5,6、時間の経過に伴うクロロフィルレベルの変化の決定を制限します。非侵襲的なクロロフィル動態の確立を可能にする方法は、時間と空間におけるクロロフィル合成プロセスの解析などの基礎的な研究課題から、ストレス耐性の評価やクロロフィル動態に対するバイオスティミュラントの効果などのより実用的な応用に至るまで、さまざまな側面で植物を研究するためのまったく新しい視点を開く可能性があります。そこで、クロロフィル形成をモニタリングするシステム「iReenCAM7」を導入しました。CCDカメラ、発光フィルター、光源、自動蛍光分析用パイプラインを内蔵しています(図1)。開発した装置の主な特徴は、空間分解能と時間分解能が高く、現在のアプローチで使用されているパラメータを上回り、標準的な分析方法と比較して十分な感度と特異性を備えていることです7

ここで説明する非侵襲的手順は、最小限の試薬を必要とし、簡単な手順で構成されているため、脱エチオレーションの非常に初期の段階で生きている シロイヌナズナ の苗木のクロロフィル動態プロファイルを得ることができます。従ってプロトコルは要因の数によって、外因性(塩、干ばつ、biostimulants、重金属、等)および内生(普通遺伝子の活動の変更と関連付けられる)によって影響されるクロロフィル統合の非常にダイナミックなプロセスの調査のために有用である場合もある従って付加的な圧力を避ける植物ティッシュを取り外しないで起源で。

Protocol

1. 培地の調製 ガラス瓶にゲル化剤0.75gと滅菌脱イオン水50mLを混合し、ペトリプレート1枚(120×120×17mm)に対して1.5%(w/v)の濃度となるように培養培地を調製する。混合物を静かに振ってから、沸騰するまで電子レンジで加熱してゲル化剤を溶かします(溶液が透明になります)。 次のステップに進む前に、培地を58〜60°Cまで冷ましてください。その後のすべてのステッ?…

Representative Results

野生型(WT)の生態型Columbia-0(Col-0)の4日齢の脱エチオレーションシロイヌナズナの苗木において、新たに開発された手順を用いて得られた典型的な出力を図3に示します。対照条件(DMSO添加MS培地)下では、クロロフィル生合成曲線はクロロフィル合成の最初のバーストから始まり、成長のスコトモルフォ形成段階で合成されたプロトクロルフィリドプールは、光によっ…

Discussion

プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ-ライトなしとマスクの世話
上記のプロトコルの説明で直接強調されているように、エチオレートされた植物の苗の栽培中またはプロトコルを開始する直前の両方で、微量の光さえも避けることは非常に重要です11。私たちのセットアップでは、ウォークインフィトトロンに配置され、光密回転ドアでフ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、欧州地域開発基金プロジェクト「SINGING PLANT」(No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446)。このプロジェクトは、欧州連合(EU)が資金提供するMSCA4Ukraineプロジェクト(ID 1233580)を通じて資金提供を受けています。 図 1 のグラフィカルなデザインをしてくれた Lenka Sochurkova に感謝します。

Materials

6-benzylaminopurine Duchefa Biochemie B0904.0001
Aluminum foil Merck Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds NASC collection N1092
Cultivation chamber PSI custom made
Dimethilsulfoxid Thermo Fisher Scientific 042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) Merck EP3123000063
Gelrite Duchefa Biochemie G1101
iReenCAM device PSI custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL Merck Z305170-10EA
Laminar-flow box UniGreenScheme ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch 3M Science. Applied to Life 7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND Merck BR780546-500EA
Micropore tape 3M Science. Applied to Life 7100225115
Osram lumilux green l18w/66 Ovalamp 200008833
Petri plates – Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented Merck Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen Merck AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software PSI delivered as a part of the iReenCAM

参考文献

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記事を引用
Balakhonova, V., Pushkarova, N., Skalak, J., Dobisova, T., Benedikty, Z., Panzarova, K., Trtilek, M., Hejátko, J. Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation. J. Vis. Exp. (203), e66087, doi:10.3791/66087 (2024).

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