概要

タンパク質間相互作用を研究するための抗エピトープタグアフィニティーゲルによる免疫沈降(英語)

Published: January 05, 2024
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概要

タンパク質間相互作用は、標的タンパク質の機能解明に重要であり、共免疫沈降(co-IP)によりPPIを容易に確認することができます。エピトープタグ付きタンパク質をコードするプラスミドをHEK-293細胞に一過性にトランスフェクションし、2つの標的タンパク質の結合を簡便に確認できる免疫沈降法を開発しました。

Abstract

タンパク質間相互作用(PPI)は、細胞組織化、細胞内シグナル伝達、転写調節などの生物学的現象において極めて重要な役割を果たします。したがって、PPIを理解することは、標的タンパク質の機能をさらに調査するための重要な出発点です。本研究では、ポリエチレンイミン法を用いて哺乳類の発現ベクターをHEK-293細胞に導入し、自家製タンパク質溶解バッファー中で細胞を溶解し、エピトープタグアフィニティーゲル上で標的タンパク質を引き下げることにより、2つの標的タンパク質の結合を決定する簡単な方法を提案します。また、種々のエピトープタグ融合タンパク質間のPPIは、エピトープタグアフィニティーゲルの代わりに各タグに対するアフィニティー抗体を用いることで確認することができます。このプロトコルは、他の細胞株からの核抽出物を含むさまざまなPPIの検証にも使用できます。そのため、様々なPPI実験の基本的な手法として活用できます。タンパク質は、長時間の経過と凍結融解の繰り返しによって分解されます。したがって、細胞溶解、免疫沈降、および免疫ブロッティングは、可能な限りシームレスに実行する必要があります。

Introduction

タンパク質は、情報処理、代謝、輸送、意思決定、構造構成など、すべての細胞機能において主要な役割を果たしています。タンパク質は、他の分子と物理的に相互作用することによってその機能を媒介します。タンパク質間相互作用(PPI)は、シグナル伝達の媒介、環境の感知、エネルギーの身体運動への変換、代謝酵素やシグナル伝達酵素の活性の調節、細胞組織の維持など、細胞機能を媒介するために重要です1。このように、PPIは未知の関数を解明するために利用できる2。PPIの検出方法は、 in vitroin vivoin silicoの3種類に分類できます。 in vitro PPI検出には、共免疫沈降(co-IP)、アフィニティークロマトグラフィー、タンデムアフィニティー精製、タンパク質アレイ、ファージディスプレイ、タンパク質フラグメント相補、X線結晶構造解析、および核磁気共鳴分光法が使用されています3。これらの方法の中で、co-IPはそのシンプルさから広く使用されています。

融合タグFLAGは、エンテロキナーゼ切断部位を含む8つのアミノ酸(AspTyrLysAspAspAspAspLys:DYKDDDDK)からなり、免疫親和性クロマトグラフィー用に特別に設計されました4。DYKDDDDKタグ付きタンパク質は、抗DYKDDDDK抗体を用いて認識され、捕捉されます。したがって、DYKDDDDK結合アガロースビーズ5 を使用して効率的に引き下げ、簡単な方法で特定のタンパク質への結合を確認します。免疫沈降は様々な細胞で行うことができ、目的のタンパク質に対する抗体を用いて幅広いPPIを確認することができます。抗DYKDDDDKアガロースビーズによる免疫沈降およびペプチド溶出は、以前に報告されています5

ここでは、DYKDDDDKタグ付きタンパク質をコードするプラスミドをHEK-293細胞に一過性に導入して、目的の2つのタンパク質の会合を確認する簡単な免疫沈降法を提供します。特定のDYKDDDDK抗体は、融合タンパク質のN末端とC末端の両方に結合できますが、他の抗体には結合できません6。したがって、混乱を避けるために、N末端とC末端の両方に融合したタグを認識する抗体を選択する必要があります。エピトープタグを挿入する場合、エピトープタグと標的タンパク質の間に3〜12塩基対を挿入することで、タンパク質の構造変化を回避できる場合があります。ただし、挿入されたシーケンスは、フレームシフトを回避するために、3の倍数のベースペアである必要があります。

Protocol

図 1 は、プロトコルの概要を示しています。 1. 溶液と緩衝液の調製 タンパク質溶解バッファー:以前に発表されたレポート7 (表1)に従って、タンパク質溶解バッファーを調製します。 タンパク質溶解バッファー + プロテアーゼ阻害剤(PI):上記の調製したバッファーにプロテアーゼ阻害剤( <stro…

Representative Results

褐色およびベージュの脂肪細胞としても知られる熱発生性脂肪細胞は、潜在的な抗肥満および抗耐糖能不耐症効果を有する。PR(PRD1-BF1-RIZ1相同)ドメイン含有16(PRDM16)は、熱発生性脂肪細胞の同一性を決定する上で重要な役割を果たす転写補因子である9,10。 EHMT1(ユークロマティックヒストン-リジンN-メチルトランスフェラ?…

Discussion

このプロトコルは、以前に報告されたプロトコル5,7,14,15とほぼ同じです。このプロトコルの重要なポイントは、細胞溶解ステップから免疫沈降ステップまで実験を決して停止しないことです。タンパク質分解はPPI検出を妨げます。長時間の経過と凍結融解のサイクルを繰り返すと、タンパク質が?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、日本学術振興会科研費19K18008(G.N.)、日本学術振興会科研費22K16415(G.N.)、JSPS科研費22K08672(H.O.)、日本糖尿病学会若手研究助成(G.N.)、MSD生命科学財団若手研究助成(G.N.)の支援を受けて行われました。

Materials

0.5 M EDTA (pH8.0) Nippon gene 311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL Biorad 4561034
10x Tris/Glycine/SDS Biorad 1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep GE Healthcare NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey GE Healthcare NA934-1ML
Cell Scraper M Sumitomo Bakelite MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm IWAKI 4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Invitrogen 10565042
D-PBS (-) FUJIFILM Wako 045-29795
Glycerol FUJIFILM Wako 072-00626
Glycine FUJIFILM Wako 077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 Cell Signaling C29F4
Laemmli Sample buffer Bio-Rad Laboratories 161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Biorad 7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels Biorad 1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Sigma F3165
NaCl FUJIFILM Wako 191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 This paper N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1 This paper N/A
pcDNA3.1-vector This paper N/A
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride PSI 24765
Penicillin-streptomycin solution FUJIFILM Wako 168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo scientific 23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether FUJIFILM Wako 168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate FUJIFILM Wako 167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs Cytiva 17061801
Protein LoBind Tubes eppendorf 30108442
ROTATOR RT-5 TAITEC RT-5
skim milk Morinaga 0652842 
Stripping Solution FUJIFILM Wako 193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack Biorad 1704156B03
Trans-Blot Turbo System Biorad N/A
Trizma base Sigma T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) HyClone SH30910.03
Veriblot Abcam ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 Cell Signaling 4970S

参考文献

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記事を引用
Shinjo, H., Nagano, G., Ishii, S., Himeno, N., Yamamoto, Y., Sagawa, J., Baba, R., Egusa, G., Hattori, N., Ohno, H. Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (203), e66085, doi:10.3791/66085 (2024).

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