このプロトコールは、免疫染色による細胞接着、オルガノイド形態、および遺伝子発現のための生体機能的自己組織化ペプチドを評価することを目的としています。結腸直腸癌細胞株を使用して、集中的なテストのためのオルガノイドを取得する費用対効果の高い方法を提供します。
超短自己組織化ペプチド(SAP)は、細胞外マトリックスに似たナノファイバーを自発的に形成することができます。これらの繊維は、生体適合性、生分解性、および非免疫原性のハイドロゲルの形成を可能にします。私たちは以前に、SAPがタンパク質由来のモチーフで生物官能基化されると、結腸直腸オルガノイド形成をサポートする細胞外マトリックス特性を模倣できることを証明しました。これらの生体機能ペプチドハイドロゲルは、元の親ペプチドの機械的特性、調整性、および印刷適性を保持しながら、細胞とマトリックスの相互作用を可能にして細胞接着を増加させる手がかりを組み込んでいます。この論文では、結腸直腸がんオルガノイドを費用対効果の高い方法で形成できる腺がんがん細胞株を使用して、細胞接着と内腔形成に対するさまざまな生体機能ペプチドハイドロゲルの効果を評価および特徴付けるために必要なプロトコルを示します。これらのプロトコルは、免疫染色および蛍光画像解析を使用して、細胞接着および管腔形成に対する生体機能ペプチドハイドロゲルの影響を評価するのに役立ちます。この研究で使用した細胞株は、以前に動物由来のマトリックス中のオルガノイドの生成に利用されています。
近年、自己組織化ペプチド(SAP)は、組織工学用途の有望な生体材料として浮上しています。SAPは、ナノファイバーの自然形成、生体適合性、生分解性、非免疫原性などのユニークな特性を有しており、足場開発の有力な候補となっています1。SAPはこれまで様々な種類の細胞と併用されてきましたが、特に報告されている超短SAPは、幹細胞のカプセル化を促進しながら、30種類以上の継代を網羅し、染色体異常の発生を最小限に抑えながら、幹細胞の多能性を維持しています2,3,4。したがって、オルガノイド培養での使用にSAPを適応させることは、合理的な次のステップを構成しました。
オルガノイドは、単一の多能性細胞から生じる複雑な三次元構造です。これらの構造は、さまざまな細胞タイプを生じさせ、その後、自己組織化して、in vitroでの胚成長および組織成長の発生過程を再現します5。この革新的なフレームワークは、in vivo 臓器に特徴的な遺伝的、表現型、および行動的特性を効率的に保存しながら、in vitro 研究のための強力なツールに進化しました6。それにもかかわらず、オルガノイドベースの所見のベンチからベッドサイドへの移行における主な障害は、再現性の必要性です7。この結果のばらつきは、主にヒト多能性幹細胞を特殊な細胞系譜に完全分化させることの難しさに起因しており、さらに、真正な組織構造の欠如とオルガノイドモデルに見られる固有の複雑さが加わります。幹細胞およびオルガノイドベースの研究8の人気が高まっていることから、動的な機械的特性を持つ生体材料や、分解性が制御されたインテグリン様の接着部位や足場に対する需要が高まっています7,9。これらの特性は、生物官能基化されたSAPを戦略的に活用することで効果的に調整することができます。
SAPは、明確に定義された構造に自発的に組織化する固有の能力を持つアミノ酸の短い配列です10。これらのペプチドは、多くの場合、疎水性残基と親水性残基を交互に含み、水素結合、静電相互作用、および疎水性効果11,12などの非共有結合相互作用を通じて自己組織化を促進します。これらのペプチドの自己組織化プロセスは、主にシステムの自由エネルギーを最小限に抑える必要性によって推進されます。水性環境では、疎水性の残留物は水への曝露を最小限に抑えるために集まる傾向がありますが、親水性の残留物は周囲の水分子と相互作用します。この現象は、さまざまなナノ構造の形成につながります。この場合、超短自己組織化ペプチドは、ペプチド配列および環境条件2,12,13,14,15,16に依存する特性を有するナノファイバーを形成する。これらのペプチドは、個々のペプチド鎖が互いに平行または逆平行に整列し、水素結合によって安定化されるβターンコンフォメーションを採用しています(図1)。陽イオンの存在は、ナノファイバー形成につながる自己組織化プロセスを加速します。
ペプチドナノファイバーは、大量の水を捕捉する生来の能力を有することが確認されています。この特性により、ヒドロゲルの生成が促進され、その後、細胞の増殖と成長を助長する生体適合性および生分解性の三次元空間として現れます。これらの自己組織化ペプチドナノファイバーは、天然の細胞外マトリックス(ECM)環境1に固有の地形的特徴を複雑に模倣します。この類似性は、細胞にその生理学的生息地を模倣する環境を与え、最適な細胞活動をさらに促進する17。さらに、これらのペプチドに固有の汎用性は、かなりの程度の同調性を可能にする4。このような適応性により、剛性、ゲル化速度、多孔性などのマトリックスの特性を変更することができます。これらの適応は、ペプチド配列の修飾によって達成されます。その結果、自己組織化ペプチド(SAP)は、現代の生体材料科学において極めて重要な構成要素として浮上し、組織再生および細胞培養の足場として広く使用されている13,17。
自己組織化ペプチドの重要な利点の1つは、分子レベルで容易に合成および修飾できることです。この利点により、特定の官能基または生理活性モチーフをペプチド配列に組み込むことができ、調整された特性および機能性を有するペプチドの設計が可能になります18,19,20(図1B)。例えば、生体官能性化されたSAPは、ECMを模倣し、RGDペプチド19,21を用いて分化を促進するように設計することができる。ペプチドBen-IKVAVは、そのリガンド特異的な動機により、ニューロン特異的マーカーの発現を有意に増加させることも報告されています22。これらのペプチドは、インテグリン結合ペプチドなどの生理活性分子を表示するように操作することもでき、細胞の生存を増強する23。最後に、他の生物官能化されたSAPは、それらの構造にIKVAVおよびYIGSRモチーフを含めることにより、血管新生を促進するために開発されている24。
以前の出版物で報告された生物官能性化されたSAPは、生物官能化されたSAPが由来するナイーブペプチドを含めることによって、自己組織化をさらに修飾できることを示している25。これらのSAP混合物は、生化学的活性と物理化学的特性が異なるさまざまなSAP製剤も提供できます。例えば、両親媒性ペプチドIIFKは、IKVAVモチーフの組み込みに代表されるように、さまざまなモチーフによる生体機能化に耐えることができる超短SAPです(図1B)。両方のペプチドは、単独でも組み合わせてもナノファイバーを形成することができます。各配合は、さまざまな物理的特性を持つハイドロゲルをもたらします(図2)
しかし、SAPの生物学的機能化から得られる可能性のある順列や代替法は多岐にわたるため、オルガノイド試験のための迅速で費用対効果の高いオプションを提供する必要があります。このような集中的で費用対効果の高いオルガノイド評価の候補の1つは、ヒト結腸直腸腺癌に由来するSW1222細胞株です26,27。SW1222細胞は、オルガノイドに似た3次元構造に凝集できる特性を有しており、組織発生や再生医療への応用研究に理想的なモデルです。SW1222細胞は、LGR5遺伝子27の固有の過剰発現により、オルガノイドを生成できると同定されている。個々のLGR5+幹細胞からのオルガノイドの作製は、SW1222細胞が結腸直腸癌オルガノイドの形態学的特性を達成する傾向と同様に、以前に説得力を持って示されてきた28。
この手法論文では、SW1222細胞を使用して、さまざまな生体機能ペプチドが細胞接着と内腔形成に及ぼす影響を評価および特性評価するための詳細なプロトコルを紹介します(図3)。段階的な手順とイメージング解析方法を提供することで、オルガノイドのバイオファブリケーションとオルガノイド培養のための単純なSAPマトリックスの評価に関する貴重な洞察を提供したいと考えています。
生物医学研究におけるSAPの大きな可能性は、バイオファンクチャリゼーションによる順応性と適応性によって強調されています。このように広範な順列が存在するため、特にオルガノイド研究において、特定のアプリケーションで最も有望な構成を効率的に試験し、決定するという課題が生じます。迅速で費用対効果の高いソリューションが最も重要です。SW1222細胞株は、ヒト結腸直腸腺が?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、キングアブドラ科学技術大学によって財政的に支援されました。著者らは、KAUSTのSeed Fund Grantと、KAUSTのInnovation and Economic Developmentが授与したイノベーションファンドを認めています。著者らは、KAUSTのBioscience and Imaging Core Labsが生物学的特性評価と顕微鏡分析をサポートしてくれたことに感謝します。
1x PBS | Gibco | 14190144 | |
6-well plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-83 | |
10x PBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 70011044 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | |
24-well plate, tissue culture treated | Corning | 09-761-146 | |
96-well black plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-565 | |
alamarBlue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1025 | |
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab40839 | Secondary used: anti-rabbit Dylight 633 |
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab16505 | Secondary used: anti-rabbit Alexa 488 |
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal | Abcam | ab190085 | Secondary used: anti-goat Alexa 488 |
BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cellpose 2.0 | NA | NA | Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose |
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan | ZEISS | LSM 880 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11055 | |
Glycine | Cytiva | GE17-1323-01 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633 | Invitrogen | 35562 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS) | Gibco | 16140071 | |
ImageJ 1.54f | NIH | NA | |
IMDM | Gibco | 12440079 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free | Corning | 356255 | Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix. |
Microscope, brightfield | |||
Microscope, EVOS | Thermo Scientific | EVOS M7000 | |
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154 | OriginLab Corp | NA | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
Round Cover Slip, 10 mm diameter | VWR | 631-0170 | |
Scanning Electron Microscope | Thermo Fisher – FEI | TENEO VS | |
Sterile 30 μm strainer | Sysmex | 04-004-2326 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | |
SW1222 cell line | ECACC | 12022910 | |
Triton x-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure water | Invitrogen | 10977015 |