この方法は、成体マウスから水晶体線維細胞を採取し、水晶体上皮細胞(LEC)が付着した莢膜バッグを残すことにより、 in vivo での白内障手術をモデル化します。その後、損傷反応は、分子的および形態学的基準を使用して、手術後のさまざまな時点で評価されます。
白内障手術(CS)は、世界中の視覚障害の主な原因である白内障の有効な治療法です。しかし、CS は眼の炎症を引き起こし、長期的には、水晶体上皮細胞 (LEC) の術後の異常増殖と筋線維芽細胞および/または異常な線維細胞への変換によって引き起こされる後嚢混濁症 (PCO) および/または水晶体脱臼を引き起こす可能性があります。しかし、ほとんどの in vitro モデルではin vivoで見られるLECの創傷治癒応答を再現していないのに対し、ウサギなどの従来の白内障手術の動物モデルでは、遺伝子発現の遺伝子操作によるメカニズムの試験ができないため、CSが炎症やPCOを引き起こす分子メカニズムはまだ不明瞭です。最近、当研究室らは、遺伝子改変マウスを用いて、炎症誘発性シグナル伝達の誘導やLEC上皮から間葉系への移行を促進する分子機構の研究に成功し、PCOの病因に関する新たな知見につながっています。ここでは、マウスの白内障手術をモデル化するための確立されたプロトコルを報告します。これにより、RNAseqを介した水晶体線維細胞の除去に対するLECの応答の堅牢な転写プロファイリング、半定量的免疫蛍光法によるタンパク質発現の評価、および炎症のような急性後遺症の病因に関与すると仮定される遺伝子の機能をテストするための最新のマウス遺伝学ツールの使用と、その後のLECの筋線維芽細胞への変換に関与していると仮定されていますおよび/または異常なレンズファイバーセル。
水晶体は高度に組織化された透明な組織であり、光を屈折させて網膜1,2,3にはっきりと焦点を合わせた画像を生成します。この特殊な器官は、途切れることのない基底膜(カプセル)に囲まれており、水晶体を目の他の部分から隔離しています。カプセルの内側の前面は、水晶体上皮細胞(LEC)の単層を固定し、水晶体上皮細胞(LEC)は、水晶体赤道で水晶体線維細胞に分化し、水晶体の大部分を構成する3。白内障は、老化、遺伝子変異、紫外線、酸化ストレス、眼の外傷などの要因により、水晶体が透明度を失ったときに発生します4。白内障は、世界中で、特に医療が不十分な国では、失明の主な原因です5。しかし、この状態は現在、中央の水晶体包と付着した水晶体上皮を切除する水晶体超音波乳化吸引術による不透明な水晶体細胞の外科的除去によって容易に治療され、続いて振動プローブを使用して水晶体の細胞塊を吸引可能な小さな断片に分解します。赤道儀LECが取り付けられたカプセルバッグを置き去りにする1.その後、最も一般的には、人工眼内レンズ(IOL)の術後移植によって視力が回復します。
白内障手術(CS)は白内障に対して非常に効果的で低侵襲な治療法ですが、眼の炎症5,6,8の発症により、患者の術後の回復が急激に妨げられる可能性があります。この炎症は、術後の痛み、網膜浮腫を引き起こし、網膜剥離を引き起こすだけでなく、ブドウ膜炎や緑内障などの他の炎症性および線維性状態の悪化を引き起こす可能性があります4,7,8,9。CS 後の眼の炎症 (PCS) は、一般に抗炎症点眼薬で治療されますが、これは患者のコンプライアンスの低下や、飛蚊症の有病率の増加につながる可能性のある点眼薬なし白内障手術に悩まされています 8,10,11。長期的には、後部被膜混濁症 (PCO) の発症により、CS の結果が損なわれる可能性があります12。PCOは、手術後に残された残留LECが創傷治癒反応を起こし、増殖し、数か月から数年で後レンズカプセルに移動するときに発生しますPCSは二次視覚閉塞に寄与します13,14。
CS がこのような急性および慢性の反応を引き起こす分子メカニズムを理解することは、この分野で大きな課題であり、PCO を調査する文献の多くが、活性形質転換成長因子ベータ (TGFβ) 12,15 による治療による培養中の筋線維芽細胞への LEC 変換の誘導に依存しています。in vitroで培養された死体レンズから作成されたヒトカプセルバッグモデルは、LECが天然の基底膜で培養されるため、レンズPCSの生物学をよりよく反映していますが、機構的に操作することは困難であり、眼内環境を再現せず、レンズ間(またはドナー間)の変動性により本質的に変動します16,17。ウサギ1,18および非ヒト霊長類19,20の白内障手術のin vivoモデルは、これらの問題のいくつかを克服するが、それでも機構研究のために操作することは容易ではない。特に、哺乳類の水晶体再生に関する先行研究では、マウスから水晶体線維細胞を採取した後、4週間以内に有意な水晶体再生が見られ、水晶体上皮細胞と被膜が残されたが、水晶体全体を除去した場合、水晶体の再増殖は起こらなかった21,22。その後、この手順を合理化し、水晶体線維細胞の除去に対するLECの急性応答と、その後の筋線維芽細胞と線維細胞特性を持つ細胞の混合集団への変換の研究に最適化しました。
この白内障手術のマウスモデルを用いて、水晶体上皮細胞は、6時間PCSでトランスクリプトームを劇的に再構築して多数の炎症性サイトカインを産生することを示しました23、一方、標準的なTGFβシグナル伝達の開始に先立つ24時間PCS12,23という早い時期に線維性マーカーを発現し始めます。このモデルを用いたノックアウトマウスでの機構実験により、LECによる細胞フィブロネクチンの発現が持続的な線維性応答PCSに必要であることが明らかになったが、これはおそらく、線維性ECMの組み立てにおけるその役割と細胞シグナル伝達の両方によるものと思われる12。他の研究では、αVβ8-インテグリンはTGFβ活性化におけるその機能のためにLECの筋線維芽細胞への移行に必要であることが示され、このアプローチが抗PCO治療リードを特定する可能性が確認されました。
ここでは、白内障手術に対するLEC応答をモデル化するために、水晶体カプセルとLECを残しながら、生きたマウス(図1および図4)から水晶体繊維細胞を取り外す方法を説明する詳細なプロトコルを提供します。
この手術技術には、高度なマウスの取り扱いと顕微手術のスキルが必要であり、開発するには練習が必要です。習得するのが最も難しいのは、傷を閉じるために角膜に細かい縫合糸を配置することです。実験者が縫合の全くの初心者であると仮定します。その場合は、まず紐と布を使って練習し、次に小さな果物に大径の縫合糸を使って練習に移り、手術用のスクエ…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立眼病研究所(EY015279およびEY028597)とデラウェア州INBRE(P20 GM103446)の支援を受けました。
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP | Baush Lomb | 24208-910-55 | |
1% Atropine sulfate ophthalmic solution | Amneal | 60219-1748-2 | |
1% Tropicamide opthalmic solution USP | Akorn | 17478-102-12 | |
10-0 Nylon suture | Ethicon | 7707G | |
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP | Akorn | 17478-200-12 | |
26 G 1/2 Needles – straight | BD PrecisionGlide | 5111 | |
27 G 45° bent dispensing tip 1" | Harfington | ||
Balanced saline solution | Phoenix | 57319-555-06 | |
Bupranorphine (0.1 mg/kg) | APP Pharmaceticals | 401730D | |
Chlorhexidine solution | |||
Needle holder 2-110 | Duckworth & Kent | 2-110-3E | |
Noyes scissors, straight | Fine Science Tools | 12060-02 | |
SMZ800 Nikon model microscope | Nikon | ||
Sterile disposable scalpel No.11 | Feather | 2975#11 | |
Tweezers #5 Dumont | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution | APP Pharmaceticals | 401730D |