ここでは、大型植物の遺伝的形質転換の in vivo 研究のための局所真空浸透のための最初のプロトコルを紹介します。この方法論を用いて、 アグロバクテリウムを介したカカオ のプランタ 一過性形質転換を世界で初めて達成しました。
一過性の プランタ 形質転換は、植物の遺伝的形質転換のための迅速で費用対効果の高い代替手段です。 Plantaの 変形のためのほとんどのプロトコルはア グロバクテリウム仲介された変形の使用に頼る。しかし、現在使用されているプロトコルは、大型プラントを真空処理にかけることの物理的および経済的制約により、小規模プラント向けに標準化されています。この研究は、大型植物用にカスタマイズされた局所的な真空ベースの農業浸透のための効果的なプロトコルを提示します。提案手法の有効性を評価するため、遺伝子組み換えに抵抗性のある熱帯植物種であるカカオ植物での使用を検証しました。私たちのプロトコールでは、カカオ葉の局所的な地上部に最大0.07MPaの真空を繰り返し適用することができ、付着した葉の細胞間空間に アグロバクテリウム を強制的に浸透させることが可能になりました。その結果、ア グロバクテリウムを介した付着カカオ葉の プランタ 形質転換における一過性現象をRUBYレポーターシステムで発現させることに成功しました。また、これはア グロバクテリウムが媒介する初めての プランタ 一過性カカオの形質転換です。このプロトコルは同じようなサイズの抑制の他の植物種に真空基づかせていたagroinfiltration方法の適用を可能にし、recalcitrant木質、大型種の遺伝子の planta の性格描写のためのドアを開ける。
植物の遺伝子組み換え法は、遺伝子の生物学的機能を調べるために不可欠であり、ポストゲノム時代に予測される多数の未解明遺伝子を考えると、今日では特に有用である1。これらの方法は、完全に形質転換された系統を取得したり、遺伝子を一過性に発現させたりするために使用できます。宿主が取り込んだ外来DNAが宿主ゲノムに完全かつ不可逆的に組み込まれ、遺伝子組み換えが次の世代に受け継がれることで、安定した形質転換が起こります。一過性形質転換として知られる一過性発現は、 アグロバクテリウム によって細胞内に移植されたT-DNAの複数のコピーから発生し、宿主ゲノムに組み込まれておらず、感染後2〜4日でピークに達します2。
一過性発現アッセイは、遺伝子の機能的特性評価に十分であり、安定した形質転換よりもいくつかの利点があることは注目に値します。例えば、一過性形質転換では、組織培養ベースの再生手順は必要ありません。もう一つの利点は、シロイヌナズナ3やニコチアナ・ベンサミアナ4などのモデル植物種で十分に標準化されたプロトコルのいくつかの成功例であるが、非モデル種5ではまだ限られている遺伝子のplanta機能解析と互換性があることである。
一過性アッセイの開発は、効率的な遺伝子導入法の利用可能性に依存しています。このため、最も一般的なアプローチは、DNAを植物細胞に移植するアグロバクテリウムのユニークな能力を利用するアグロバクテリウム浸潤に基づいています6。これらの分析には、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-グルクロニダーゼ(GUS)、ルシフェラーゼ、RUBYなどのレポーター遺伝子の使用も有用なツールであり、これらはすべて形質転換イベントの追跡に用いられます。これらのレポーターシステムの中で、RUBYは現在最も可視化が容易であり、3つの酵素ステップ反応によるチロシンのベタレインへの変換に依存しています。他のレポーターシステムとは対照的に、得られたベタレインは、高度な装置や追加の反応物を必要とせずに、形質転換された植物組織上の明るい色の色素として容易に観察することができます7。
アグロバクテリウム懸濁液を葉肉の細胞間空間に浸潤させる場合、アグロ感染を成功させるための最も重要なステップは、葉の表皮クチクラによって課せられる物理的障壁を克服することです8。一部の植物では、Nicotiana benthamiana9で発生するように、針なしシリンジ(シリンジAgroinfiltration)で作成された圧力勾配が効率的な農業浸透に十分であるが、他の植物種は、真空ポンプ10の助けを借りて作成されたようなより大きな圧力勾配を必要とする場合がある。真空アシストプロセスでは、アグロインフィルトレーションは2つのステップで行われます。最初のものでは、真空は植物材料を減圧する役割を果たし、気孔や創傷を通して葉肉の空気空間からガスを強制的に放出します。その後、再加圧段階では、アグロバクテリウム懸濁液が気孔および創傷を介して細胞間空間に浸潤する11。
シリンジ浸潤と比較して、真空浸潤は、より高い使用頻度、再現性、および浸透プロセスのあらゆる段階で圧力および持続時間を制御する能力を可能にする10。ほうれん草(Spinacia oleracea)12、牡丹(木本多年生植物)(Paeonia ostii)13、ササゲ(Vigna unguiculata)14などの異なる植物種の葉では、真空農業浸透プロトコルは、シリンジ浸透よりも深い浸透率を達成しました。同様に、トマト(Lycopersicon esculentum)15、ガーベラ(Gerbera hybrida)16では、真空農業浸潤はシリンジ浸潤よりも強力で均一な遺伝子サイレンシングを引き起こした。真空浸潤のさらなる利点は、最近3つの柑橘類品種(Fortunella obovata、 Citrus limon、 C. grandis)で観察された注射器浸潤と比較して、遺伝子型への依存性が低いことです17。しかし、デシケーターに収まらないほど大きすぎる植物に真空農業浸透を適用しようとすると、熱帯の木本植物で典型的に発生するように、真空チャンバーのサイズが制限になる可能性があります。
以下では、真空チャンバーの空間的限界を克服し、カカオ葉のプランタ一過性形質転換におけるその有用性をテストするプロトコルについて説明します。カカオの最初の局所真空浸透法を提示し、追加の機器を必要とせず、植物全体の浸透に使用されるのと同じ実験室用デシケーターの使用さえ可能にしますが、真空チャンバー内の植物の一部へのアクセスを可能にする簡単な適応で、植物開発のさまざまな段階での使用を可能にします。今回提案した局所真空浸透法の有用性を検証するため、形質転換が困難な大葉熱帯植物種の代理としてカカオを選定した。この局所浸潤法を用いて、アグロバクテリウムを介した真空浸潤によるアボカドのオオバコ一過性発現を、これまで剥離葉に最適化していた条件で初めて報告し18、本稿ではカカオにおけるオオバコ一過性発現を初めて報告する。
本研究では、カカオ植物を例に、木本植物の プランタ一 過性形質転換のための効率的で低コストな農業浸透プロトコルを提示した。葉のクチクラが植物組織の形質転換に及ぼす制約はよく知られているため、通常はこの手順に抵抗する木本植物の真空による農業浸透を促進する戦略の開発に集中しました。
真空チャンバー内の真空圧は、デシケーター、木の枝、…
The authors have nothing to disclose.
Licに感謝します。ヘスス・フエンテス・ゴンサレス氏とネストル・イバン・ロブレス・オリバレス氏には、ビデオ映像の撮影に協力していただきました。CIATEJ(テオブロマ・カカオ 植物)のアントニア・グティエレス・モラ博士からの寛大な贈り物に感謝します。また、CIATEJとメキシコのLaboratorio Nacional PlanTECCの施設支援にも感謝します。H.E.H.D.(CVU:1135375)は、Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, México(CONAHCYT)の資金提供を受けて修士研究を実施しました。R.U.L.は、ハリスコ州サンフランシスコ市立技術研究所(COECYTJAL)およびメキシコ・ハリスコ州イノバシア工科大学事務局(SICYT)(助成金7270-2018)の支援に感謝の意を表します。
35S:RUBY plasmid | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
1 mm electroporation cuvette | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
Desiccator | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
Freeze dryer | LABCONCO | 700402040 | |
K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | For YM medium add 0.38 g/L |
LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | For YM medium add 10 g/L |
MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (For LB, YM and resuspension medium) add 1.95 g/L (10mM) |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | For resuspension medium add 0.952 g/L (10 mM) |
MgSO4·7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | For YM medium add 0.204 g/L |
MicroPulser Electroporation Apparatus | Biorad | 165-2100 | |
NaCl | Karal | 60552 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.1 g/L |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
President Silicone Impression material | COLTENE | 60019938 | |
Rifampicin | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
Silicone Impression material gun | Andent | TBT06 | |
Spectinomycin | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
Streptomycin | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
Tryptone enzymatic digest from casein | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | For LB medium add 10 g/L |
Yeast extract | MCD LAB | 9031 | For LB medium add 5 g/L; For YM medium add 0.4 g/L |