Использование изображений ex vivo в реальном времени для исследования деления и движения клеток во время обновления зубов мыши

За последние два десятилетия резцы мыши стали бесценной платформой для исследования принципов регуляции взрослых стволовых клеток и регенерации зубов ^1,2. Резец мыши постоянно растет и обновляется на протяжении всей жизни животного. Это достигается за счет поддержания как эпителиальных, так и мезенхимальных стволовых клеток, которые могут самообновляться и дифференцироваться в различные типы клеток зуба ^1,2. В то время как зубные эпителиальные стволовые клетки дают начало амелобластам, которые секретируют эмалевый матрикс, зубные мезенхимальные стволовые клетки дают начало одонтобластам, цементобластам и фибробластам, которые образуют дентин, цемент и периодонтальную связку соответственно 3,4,5,6. Это постоянное поступление новых клеток поддерживает гомеостаз тканей и позволяет заменять старые клетки, которые теряются из-за жевательного износа или травм ^7,8. Таким образом, выяснение клеточных и молекулярных механизмов, регулирующих поддержание и дифференцировку стоматологических стволовых клеток, занимает центральное место в понимании регенерации зубов, области, представляющей растущий интерес.

Анатомически большая часть резцов взрослой мыши заключена в челюстную кость. В то время как режущий край зуба обнажен, апикальный конец резца входит в лунку и прочно прикрепляется к окружающей кости через периодонтальные связки и соединительные ткани (рис. 1A, B). Апикальный конец резца также является областью роста зуба и поддерживает стволовые и прогениторные клетки зуба как в эпителиальном слое, так и в мезенхимальной пульпе 9,10,11,12,13. В частности, стволовые клетки зубного эпителия поддерживаются на луковичном конце эпителия, известном как апикальная почка, также называемая губной шейной петлей (рис. 1C). Подобно эпителию кишечника и эпидермису, обновление эпителия в резце в основном поддерживается активно циркулирующими стволовыми клетками и их высокопролиферативными промежуточными потомками, называемыми транзитно-амплифицирующими клетками^{14, 15, 16, 17}, расположенными во внутренней части шейной петли. Тем не менее, содержит ли эпителий резца и использует ли он покоящиеся стволовые клетки во время регенерации, еще предстоит определить. Напротив, в апикальной пульпе были идентифицированы как активные, так и неподвижные зубные мезенхимальные стволовые клетки, а неподвижные стволовые клетки функционируют как резервная популяция, которая активируется во время восстановления травмы^13,18.

Многие из открытий в области биологии обновления и регенерации резцов мышей являются результатом гистологических исследований, в ходе которых образцы получают в различных временных точках, фиксируют, обрабатывают, а затем разрезают на микронные тонкие срезы вдоль определенной плоскости. Благодаря детальному анализу гистологических срезов различных мышиных моделей, которые позволяют отслеживать родословную или генетические возмущения, ученые определили клеточные линии различных популяций предшественников, а также генетические и сигнальные пути, которые контролируют гомеостаз резцов и восстановление повреждений 19,20,21. Однако статические двумерные (2D) изображения невитальных клеток в разрезах не могут охватить весь спектр клеточного поведения и пространственных организаций в живой ткани, таких как изменения формы клеток, движения и клеточная кинетика. Обнаружение и измерение этих быстрых клеточных изменений, которые происходят в масштабе времени, неразрешимом с помощью срезов тканей, требуют другой стратегии. Более того, получение такой информации также имеет решающее значение для понимания того, как зубные клетки взаимодействуют друг с другом, реагируют на различные сигнальные стимулы и самоорганизуются для поддержания тканевых структур и функций.

Появление четырехмерной (4D) визуализации глубоких тканей с использованием двухфотонной микроскопии²², технологии, которая объединяет три пространственных измерения с временным разрешением, преодолевает ограничения, присущие гистологическому анализу, позволяя проводить пространственно-временное исследование культивируемых тканевых эксплантов, органоидов или даже тканей in situ 23,24,25,26 . Например, 4D-визуализация развивающегося эпителия зуба в реальном времени выявила пространственно-временные закономерности деления и миграции клеток, которые координируют рост тканей, формирование сигнального центра и морфогенез зубного эпителия 27,28,29,30,31,32. В резце взрослой мыши 4D-визуализация недавно была адаптирована для изучения клеточного поведения во время восстановления повреждений зубного эпителия. Визуализация в реальном времени показала, что промежуточные клетки слоя в надбазальном слое могут быть непосредственно преобразованы в амелобласты в базальном слое для регенерации поврежденного эпителия, что бросает вызов традиционной парадигме восстановления повреждений эпителия¹⁵.

Здесь мы опишем вскрытие, культивирование и визуализацию резца взрослой мыши, уделяя особое внимание эпителиальным клеткам в губной шейной петле (рис. 1). Этот метод сохраняет жизнеспособность зубных клеток в течение более 12 часов и позволяет отслеживать флуоресцентно меченные клетки в реальном времени с разрешением одной клетки. Этот подход позволяет исследовать движение и миграцию клеток, а также динамические изменения формы клеток и ориентации деления в нормальных условиях культивирования или в ответ на генетические, физические и химические возмущения.