In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

A somatosensação, codificação neural de estímulos mecânicos, térmicos e químicos que incidem sobre a pele ou outras estruturas corporais, incluindo músculos, ossos e vísceras, inicia-se com a atividade em neurônios aferentes primários que inervam essas estruturas¹. Abordagens eletrofisiológicas baseadas em unidades únicas têm fornecido uma riqueza de informações sobre os subtipos aferentes envolvidos nesse processo, bem como como suas propriedades estímulo-resposta podem mudar ao longo do tempo ^1,2,3. No entanto, embora ainda existam fortes evidências em apoio à teoria da linha marcada, que sugere que modalidades sensoriais específicas são transmitidas por subpopulações específicas de neurônios, a capacidade de muitas subpopulações de neurônios de responder aos mesmos tipos de estímulos mecânicos, térmicos e químicos sugere que a maioria dos estímulos somatossensoriais é codificada por múltiplas subpopulações de neurônios^{4, 5º}. Assim, uma melhor compreensão da somatosensação só virá com a capacidade de estudar a atividade de 10, senão centenas, de neurônios simultaneamente.

Os avanços nas abordagens ópticas com o advento relativamente recente de técnicas de imagem confocal e, posteriormente, multifóton e digital têm facilitado a capacidade de realizar análises populacionais relativamente não invasivas da atividade neuronal ^6,7. Um dos últimos obstáculos na aplicação dessa tecnologia tem sido o desenvolvimento de ferramentas que possibilitem a avaliação óptica da atividade neural. Dada a velocidade de um potencial de ação que pode começar e terminar em menos de um milissegundo, um corante sensível à voltagem com a capacidade de acompanhar mudanças no potencial de membrana na velocidade de um potencial de ação seria a ferramenta ideal para esse fim. Mas, embora tenha havido um tremendo progresso nessa área 7,8,9,10, a relação sinal-ruído para muitos desses corantes ainda não é alta o suficiente para permitir uma análise populacional de centenas de neurônios em nível de célula única. Como uma abordagem alternativa, os investigadores têm se voltado para o monitoramento de mudanças na concentração intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). As limitações dessa estratégia foram claras desde o início e incluem o fato de que um aumento na [Ca²⁺]_i é uma medida indireta da atividade neural¹¹; que um aumento na [Ca²⁺]_i pode ocorrer independentemente do influxo de Ca²⁺ associado à ativação de canais de Ca²⁺ dependentes de voltagem (VGCCs)^12,13; que a magnitude e a duração de um transiente de Ca²⁺ podem ser controladas por processos independentes da atividade do VGCC 11,12,14; e que o curso temporal dos transitórios de Ca²⁺ excede em muito o de um potencial de ação¹⁵. No entanto, há uma série de vantagens significativas associadas ao uso de Ca²⁺ como uma medida indireta da atividade neural. Não menos importante é a relação sinal-ruído associada à maioria dos indicadores de Ca²⁺, refletindo tanto a magnitude da mudança no Ca²⁺ intracelular quanto o fato de que o sinal está surgindo do espaço tridimensional do citosol e não do espaço bidimensional da membrana celular. Além disso, com o desenvolvimento de indicadores de Ca²⁺ codificados geneticamente (GECI’s), é possível tirar proveito de estratégias genéticas para direcionar a expressão dos indicadores de Ca²⁺ em subpopulações específicas de células, facilitando análises em nível populacional em preparações intactas (por exemplo, ver¹⁶).

Dado o número de ferramentas genéticas agora disponíveis em camundongos, não deve ser surpresa que as GECI tenham sido usadas mais extensivamente nesta espécie. Linhagens de camundongos com expressão constitutiva de GECI em subpopulações de neurônios sensoriais têm sido desenvolvidas ^7,16,17. Com o desenvolvimento de linhagens de camundongos expressando recombinases em tipos celulares específicos, é possível utilizar estratégias ainda mais sofisticadas para controlar a expressão de^GECI15. No entanto, embora essas ferramentas sejam cada vez mais poderosas, há uma série de razões pelas quais outras espécies, como ratos, podem ser mais apropriadas para algumas questões experimentais. Estes incluem o tamanho maior, facilitando uma série de manipulações experimentais que são difíceis, se não impossíveis, no rato menor; a facilidade de treinar ratos em tarefas comportamentais relativamente complexas; e pelo menos algumas evidências de que as propriedades biofísicas e os padrões de expressão de vários canais iônicos em neurônios sensoriais de ratos podem ser mais semelhantes aos observados em neurônios sensoriais humanos do que os mesmos canais em camundongos em relação ao humano¹⁸.

Enquanto a transdução dos estímulos somatossensoriais geralmente ocorre nos terminais periféricos dos aferentes primários, o potencial de ação iniciado na periferia deve passar pela estrutura que abriga os somas aferentes primários, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG) ou trigeminal (TG), antes de atingir o sistema nervoso^central19. Embora haja evidências de que nem todo potencial de ação que se propaga ao longo de um axônio aferente primário invadirá o corpo celular²⁰, consequência do fato de os somatas aferentes primários estarem conectados ao axônio aferente principal através de uma junção T¹⁹, a maioria dos potenciais de ação iniciados na periferia parece invadir o soma²¹. Isso confere três vantagens experimentais ao usar GECIs para avaliar a codificação populacional em aferentes primários: o grande tamanho do corpo celular em relação aos axônios aumenta ainda mais o sinal para ruído quando se usa [Ca²⁺]_i como uma medida indireta de atividade aferente; os DRG são geralmente de fácil acesso; e avaliar a atividade em um local espacialmente distante dos terminais aferentes minimiza o impacto potencial da cirurgia necessária para expor os gânglios sobre as propriedades estímulo-resposta dos terminais aferentes. No entanto, como os TG estão localizados abaixo do cérebro (ou acima da paleta), eles são muito mais difíceis de acessar do que o DRG. Além disso, embora existam muitas semelhanças entre os neurônios DRG e TG, há uma lista crescente de diferenças também. Isso inclui a organização aproximadamente somatotópica dos neurônios no TG²², estruturas únicas inervadas, diferentes padrões terminais centrais 23,24,25,26 e, agora, uma lista crescente de diferenças tanto na expressão gênica^27,28 quanto na expressão funcional do receptor²⁹. Além disso, como estamos interessados na identificação de mecanismos periféricos de dor, o número relativamente grande de síndromes dolorosas que parecem ser exclusivas do sistema trigeminal (por exemplo, enxaqueca, neuralgia do trigêmeo, síndrome da ardência bucal) que parecem envolver atividade aberrante em aferentes primários 30,31,32, sugere que o GT precisa ser estudado diretamente.

Assim, enquanto as propriedades estímulo-resposta dos neurônios TG têm sido estudadas com GECIs em^{camundongos 16}, porque as razões listadas acima sugerem que o rato pode ser uma espécie mais apropriada para abordar uma variedade de questões experimentais, o objetivo do presente estudo foi desenvolver uma abordagem para usar GECIs para estudar neurônios TG no rato. Para isso, utilizamos uma abordagem viral para conduzir a expressão do GECI GCaMP6s no sistema nervoso periférico. Em seguida, removemos o prosencéfalo para permitir o acesso ao GT. Finalmente, estímulos mecânicos e térmicos foram aplicados na face, enquanto as respostas neuronais foram avaliadas em microscopia fluorescente. Juntos, esses dados suportam um papel para a utilização do rato para investigar mudanças no TG sob muitos estados, expandindo o kit de ferramentas para investigadores interessados em codificação sensorial no sistema trigeminal.