Imágenes en tiempo real de la dinámica del calcio acrosómico y la exocitosis en espermatozoides de ratón vivos
概要
El modelo de ratón AcroSensE y los métodos de obtención de imágenes de células vivas descritos aquí proporcionan un nuevo enfoque para estudiar la dinámica del calcio en el compartimento subcelular del acrosoma, el espermatozoide, y cómo regulan los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.
Abstract
La exocitosis acrosómica (EA), en la que la única vesícula exocitótica del espermatozoide se fusiona con la membrana plasmática, es un proceso complejo dependiente del calcio esencial para la fertilización. Sin embargo, nuestra comprensión de cómo la señalización del calcio regula la EA aún es incompleta. En particular, la interacción entre la dinámica del calcio intraacrosómica y los pasos intermedios que conducen a la EA no está bien definida. Aquí, describimos un método que proporciona información espacial y temporal sobre la dinámica del calcio acrosómico y su relación con la fusión de la membrana y la posterior exocitosis de la vesícula acrosómica. El método utiliza un nuevo ratón transgénico que expresa un sensor de exocitosis dirigido a acrosomas (AcroSensE). El sensor combina un indicador de calcio codificado genéticamente (GCaMP) fusionado con mCherry. Esta proteína de fusión fue diseñada específicamente para permitir la observación simultánea de la dinámica del calcio acrosómico y los eventos de fusión de membrana. La monitorización en tiempo real de la dinámica del calcio acrosómico y de los EA en espermatozoides vivos de AcroSensE se logra mediante una combinación de imágenes de alta velocidad de fotogramas y un sistema de administración de estimulantes que puede dirigirse a un solo espermatozoide. Este protocolo también proporciona varios ejemplos de métodos básicos para cuantificar y analizar los datos sin procesar. Debido a que el modelo AcroSensE está codificado genéticamente, su importancia científica puede aumentarse mediante el uso de herramientas genéticas fácilmente disponibles, como el cruzamiento con otros modelos genéticos de ratón o métodos basados en la edición de genes (CRISPR). Con esta estrategia, se pueden resolver los roles de las vías de señalización adicionales en la capacitación y fertilización de los espermatozoides. En resumen, el método descrito aquí proporciona una herramienta conveniente y efectiva para estudiar la dinámica del calcio en un compartimento subcelular específico, el acrosoma, y cómo esa dinámica regula los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.
Introduction
Los espermatozoides adquieren la capacidad de fertilizar durante un proceso llamado capacitación1. Un punto final de este proceso es que los espermatozoides adquieren la capacidad de sufrir EA. Más de dos décadas de datos respaldan la presencia de un modelo complejo y de varios pasos de EA en espermatozoides de mamíferos (resumido en 2,3). Sin embargo, el estudio de la EA en espermatozoides vivos es un reto, y los métodos disponibles actualmente para monitorizar este proceso con una resolución adecuada son engorrosos y requieren múltiples pasos de preparación4, se limitan a la detección del paso final de la EA (por ejemplo, utilizando PNA5), se limitan a las mediciones de los cambios en el calcio citosólico (en contraste con la dinámica del calcio acrosómico), o se limitan a mediciones de la dinámica del calcio citosólico o de la EA6.
Para superar algunas de las limitaciones clave de los estudios de EA en tiempo real en condiciones fisiológicas y para permitir la investigación de la interacción entre la dinámica del calcio y la EA, se generó un modelo de ratón único. En este modelo de ratón, una proteína de fusión compuesta por el sensor Ca2+ codificado genéticamente (GCaMP3) y mCherry se expresa y se dirige al acrosoma, utilizando un promotor de acrosina y el péptido de señalización2. El sensor dual GCaMP3-mCherry permite realizar mediciones simultáneas en tiempo real de las concentraciones de calcio y el estado del contenido acrosómico en espermatozoides vivos en condiciones fisiológicas utilizando microscopía y un sistema de administración de estimulantes de una sola célula (Figura 1). Como componente de la matriz acrosómica, la fusión de membranas y la EA darían lugar a la pérdida de la fluorescencia mCherry fotoestable e insensible al pH de los espermatozoides, ya que esta proteína se difunde fuera de la vesícula acrosómica. En este sentido, la capacidad del modelo para reflejar el momento y la aparición de EA es similar a los beneficios de la línea de ratón GFP dirigida al acrosoma, 7,8,9.
La variante GCaMP3 utilizada en esta línea de ratones transgénicos tiene un KD aproximado de 400 μM y un rango dinámico para Ca2+ de 10-4-10-3 M10, que es adecuado para esta vesícula. Demostramos que esta combinación de características de GCaMP3 podría revelar la formación de poros de fusión entre la membrana plasmática y la membrana acrosómica externa (OAM)2. La detección de poros de fusión es el resultado de que el tamaño de los poros es demasiado pequeño para permitir que la proteína AcroSensE se disperse fuera del acrossoma (a través de la pérdida del contenido de acrosoma) mientras proporciona un “canal” de membrana que permite la entrada de iones Ca2+ en la luz del acrosoma, lo que lleva a un aumento en la intensidad de fluorescencia del GCaMP3.
La proteína fluorescente mCherry, brillante, monomérica y no sensible al calcio, favorece la visualización del acrosoma mientras la señal GCaMP3 es débil (por ejemplo, antes de la unión de Ca2+ , Figura 2) y, lo que es más importante, también permite la identificación de espermatozoides intactos con acrosomas adecuados para la obtención de imágenes.
El siguiente protocolo describe la utilización del modelo de ratón único AcroSensE y los métodos de microscopía utilizados experimentalmente para estudiar la dinámica del calcio de los EA y los espermatozoides con alta resolución espacial y temporal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se describe un método basado en microscopía para utilizar el modelo de ratón AcroSensE recientemente generado para el monitoreo y análisis en tiempo real de una sola célula de la interacción entre la dinámica del calcio acrosómico y los pasos intermedios que conducen a la EA. Junto con los enfoques genéticos fácilmente disponibles, como el cruzamiento con otros modelos genéticos de ratón o la edición de genes, este modelo y método proporcionan un poderoso sistema para estudiar el papel de varios comp…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01-HD093827 y R03-HD090304 de los Institutos Nacionales de Salud (A.J.T).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
参考文献
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